钙调蛋白对骨骼肌炎症的干扰效应

目的探讨钙调蛋白(Calmodulin,CaM)对急性骨骼肌炎症反应的影响。方法心毒素(Cardiotoxin,CTX)肌内注射,诱导C57BL/6小鼠胫骨前肌(tibialis anterior,TA)急性损伤。肌损伤小鼠腹腔注射钙调蛋白抑制剂R24571或激动剂CALP1。分别检测TA肌组织自身抗原和TLRs表达以及单核/巨噬细胞的肌内浸润程度。结果 CTX注射导致急性肌损伤,TA肌内出现大量的炎性渗出,并伴随肌纤维坏死。损伤肌组织内CaM、自身抗原(Mi-2,HRS和Ku70)以及TLR3表达上调。较之CTX损伤组,CALP1处理导致损伤TA肌内单核/巨噬细胞数量增多,肌内自身抗原和TLR3 mRNA和蛋白水平上调,R24571则减少肌内炎性浸润并下调上述炎性介质。结论 CaM信号参与介导急性骨骼肌炎症反应。

体外炎性环境下小鼠成肌细胞/分化肌管的免疫特性研究

目的对体外炎性环境下小鼠成肌细胞/分化肌管的免疫学特性进行检测,分析其是否具备抗原呈递功能。方法用IFN-γ刺激小鼠成肌细胞(C_2C_(12))及马血清诱导分化后的肌管,通过免疫荧光染色、q-PCR、Western blot、流式细胞术检测细胞表面H-2k^b、MHC-II、TLR3及相关细胞因子水平的改变。结果 IFN-γ刺激后,免疫荧光染色、q-PCR、Western blot均检测到成肌细胞/分化肌管表面MHC分子表达上调,Western blot检测到TLR3表达上调,q-PCR检测到细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1及TGF-β表达上调。结论在炎性条件下,成肌细胞/分化肌管具备炎性细胞表征,具备抗原呈递功能。

PNIPAM温敏水凝胶诱导小鼠骨骼肌慢性炎症

目的探讨肌内注射PNIPAM温敏水凝胶诱导小鼠骨骼肌慢性炎症的可行性。方法将PNIPAM或其与重组人骨骼肌C蛋白的混合物注入C57BL/6小鼠胫骨前肌(TA),于注射后15、30及60 d分别检测TA肌内单核/巨嗜细胞渗出、肌肉自身抗原表达、MHC-I表达及肌内CD8+T细胞浸润。结果 PNIPAM温敏水凝胶可诱导TA肌内炎症持续达60 d,炎症反应的高峰出现于注射后30 d,随后逐渐减退。PNIPAM水凝胶与C蛋白混合液注射所诱发的肌内炎症较单纯的PNIPAM或C蛋白注射诱发的炎症反应更持久。免疫荧光分析证实,PNIPAM水凝胶注射后可见TA肌内出现CD8+T细胞浸润,部分新生肌纤维表达MHC-I。结论 PNIPAM温敏水凝胶肌内注射可诱导小鼠慢性骨骼肌损伤及炎症反应。

NO抑制体外IFN-γ刺激成肌细胞/肌管NLRP3炎性小体活化

目的观察一氧化氮供体硝普钠(SNP)、一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对体外炎性培养(IFN-γ刺激)成肌细胞/肌管NLRP3炎症小体活化的影响。方法利用IFN-γ刺激小鼠C2C12成肌细胞/肌管,q PCR和Western blot分析炎性小体(ASC、NLRP3、caspase-1)的形成及活化、ELISA检测细胞培养上清IL-1β的分泌。进一步利用L-NAME和SNP处理IFN-γ诱导的C2C12细胞/肌管,分析炎性小体的形成、活化及IL-1β的分泌。结果 IFN-γ刺激培养后,成肌细胞/肌管中NLRP3、ASC和mature-caspase-1表达水平上调(P<0.01)。较之未刺激的细胞,IFN-γ诱导会显著上调成肌细胞/肌管培养基中的IL-1β浓度(P<0.01)。SNP处理后6 h,分化肌管(IFN-γ刺激48 h)内炎性小体(ASC、NLRP3、caspase-1)mRNA和蛋白水平较单纯刺激细胞显著下调(P<0.01),L-NAME则上调ASC、NLRP3、caspase-1表达水平(P<0.05)。与上述结果一致,SNP和L-NAME处理同时分别下调或上调培养基中IL-1β浓度(P<0.05)。结论在炎性条件下,成肌细胞/肌管具备合成并活化NLRP3炎性小体的能力。NO对炎性小体的形成及活化有一定的抑制作用。

骨骼肌特异表达卵清蛋白(OVA)抗原转基因小鼠构建

目的利用PiggyBAC转座酶系统及受精卵注射法,将MCK3E-OVA-pA随机插入小鼠基因组,获得骨骼肌特异表达卵清蛋白(OVA)的转基因小鼠(Muscle-OVA Tg)。方法通过体外转录,获得PiggyBAC mRNA;将PiggyBAC mRNA和含有鸡全长OVA片段、骨骼肌肌酸激酶启动子(MCK)、H-2K^b引导序列、H-2Db跨膜序列的质粒显微注射至C57BL/6J小鼠受精卵中,获得转基因阳性首建鼠。将Muscle-OVA Tg鼠与野生B6小鼠杂交建系。PCR鉴定小鼠基因型;Westernblot检测小鼠各组织中OVA蛋白表达以验证其组织特异性。结果PCR检测表明,Muscle-OVA Tg的肌组织表达OVA mRNA;Western blot进一步证实Muscle-OVA Tg小鼠骨骼肌组织特异的OVA蛋白表达,其他组织/器官,如心、脾、肺、肾组织OVA表达均呈阴性。结论利用PiggyBAC转座酶系统成功构建骨骼肌特异表达鸡OVA抗原的转基因小鼠,为相关的骨骼肌免疫反应研究提供了有价值的动物模型。

HSNGLPL短肽修饰的聚氨酯的体内反应性分析

目的研究短肽HSNGLPL修饰的聚氨酯在体内与体外的生物相容性与生物活性。方法将单纯的HSNGLPL短肽溶液、三种不同浓度HSNGLPL短肽修饰的聚氨酯(P-PU)及聚氨酯(BDOPU)注射或种植在小鼠体内或在体外与C2C12细胞共培养,通过H&E检测体内局部炎症渗出、免疫荧光检测体内单核/巨噬细胞渗出凋亡和肌纤维的再生以及通过细胞增殖毒性反应检测体外共培养结果。结果在体外,BDO-PU、L-P-PU和M-P-PU是合格的生物材料,具有优良的生物相容性;在体内,BDO-PU只在材料28d诱发持久的单核/巨噬细胞的渗出和肌纤维的坏死,而P-PU在肌肉内诱发的炎症、坏死反应比BDO-PU更加复杂、持久,持续时间甚至超过56d。对于细胞凋亡而言,P-PU材料周围凋亡的巨噬细胞数却明显的低于BDO-PU组。结论 HSNGLPL修饰的聚氨酯在体内与体外具有生物活性及优良的生物相容性。

敲减钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅳ抑制干扰素-γ诱导C2C12细胞免疫分子的表达

目的探究敲减钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅳ(Ca MKⅣ)基因对炎性培养条件下C2C12细胞免疫分子表达的影响。方法采用慢病毒基因干扰技术敲减C2C12细胞的Ca MKⅣ基因,以2%马血清将C2C12细胞分化成肌管,以干扰素-γ(IFN-γ)刺激C2C12细胞,采用Real-time PCR和Western blotting检测Ca MKⅣ的表达,采用Western blotting和免疫荧光检测免疫分子主要组织相容性复合体(MHC) classⅠ(H-2Kb)、MHC classⅡ(H2-Ea)、Toll样受体3(TLR3)的表达,采用Real-time检测肌细胞分泌型促炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α和单核细胞趋化因子(MCP)-1的基因表达。结果 IFN-γ可诱导成肌干细胞以及分化肌管表达或上调表达免疫分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、TLR3,同时上调C2C12细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α和MCP-1的基因表达量;敲减Ca MKⅣ基因导致上述上调趋势被抑制。结论敲减Ca MKⅣ基因可有效抑制IFN-γ诱导的免疫分子的表达,可能提示Ca MKⅣ参与调节肌细胞的免疫学特性。