永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。

辽宁省2011年度出生缺陷监测资料分析报告

目的了解辽宁省出生缺陷发生状况,探讨降低其发生的有效措施。方法按照国家出生缺陷监测方案,收集2011年度辽宁省90所出生缺陷监测医院上报的围产儿及出生缺陷儿资料,分析出生缺陷发生率及其流行病学特征。结果辽宁省2011年围产期出生缺陷发生率为97.60/万,城镇和多胎的出生缺陷发生率高于农村和单胎发生率,小于20岁和大于35岁两个年龄组的产妇出生缺陷发生率高于其他年龄组,死亡围产儿中出生缺陷者占41.48%,孕中期产前诊断并终止妊娠的出生缺陷儿占全部检出出生缺陷的39.24%。结论辽宁省实施的产前筛查、产前诊断等二级预防措施可有效降低围产期出生缺陷发生率。

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞,筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果:消化法分离的细胞约1周长成单层,组织块贴壁法约2周长满单层,但活力更高;PRCs主要形态为长梭形和大理石样,呈现为2种形态细胞混合生长;差速消化法纯化细胞后,经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞;细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上,本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基,该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变,为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

辽宁省项目县实施母亲安全活动效果评价

辽宁省妇幼卫生合作项目 1996年启动 ,1999年卫生部与联合国儿童基金会对项目工作调整 ,确定辽宁岫岩县、新宾县、义县、盖州市、抚顺县、桓仁县、彰武县、铁岭县、喀左县、新民市为“基层卫生与妇幼保健合作项目县”,2 0 0 0年 9月终期审评。审评结果表明 ,通过项目工作实施母亲安全活动 ,家庭主要成员相关知识知晓率上升了 16 .2个百分点 ,住院分娩率增长 2 1.9% ,高危孕妇住院分娩率提高至 99.9% ,孕产妇死亡率降至 19.0 / 10万 ,婴儿死亡率降至 14.2‰。切实提高了项目县妇幼卫生服务能力和群众自我保健意识 ,有效地改善了农村妇女儿童健康状况 ,为辽宁省贫困地区开展妇幼卫生工作 ,减少孕产妇和婴儿死亡探索了经验。

新世纪初期辽宁省继续医学教育工作的探讨

世纪之交,辽宁省继续医学教育工作面临新的挑战和机遇。在实践中,积极探讨新形势下坚持用唯物论观点处理好各种工作,提高卫生队伍专业素质。为此,提出主要抓好的4项工作。

依托卫生信息平台建设妇幼健康服务管理信息系统的探讨

目的利用互联网实时、动态、准确、高效地收集妇幼健康服务个案信息,建立妇幼健康服务管理信息数据库,提供数据的查询、利用、共享和分析,为政策的科学决策提供依据。方法结合辽宁妇幼健康服务管理现状,参照原卫生部《基于区域卫生信息平台的妇幼保健信息系统建设技术解决方案(试行)》和原卫生部《妇幼保健信息系统基本功能规范(试行)》要求,设计辽宁妇幼健康服务管理信息系统。结果从建设重要性、建设原则、建设目标、系统构成与功能、系统特点等方面提出了辽宁妇幼健康服务管理信息系统设计构想。结论应用计算机和网络通讯技术等现代化手段,实时动态掌握妇女儿童健康状况,监管妇幼保健服务情况,提升辽宁妇幼健康服务管理和决策水平。

农村妇女宫颈癌和乳腺癌制度化筛查模式的探讨

妇女宫颈癌和乳腺癌（＂两癌＂）是危害妇女健康的常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势。对两种癌症通过早发现、早诊断、早治疗,可以降低治疗成本,提高患病妇女的生存率,已被公认是恶性肿瘤防治中最有效的措施〔1〕。近年来我省持续实施国家农村妇女＂两癌＂免费检查项目,在开展大面积健康人群筛查中积累了一定经验,在此基础上对农村妇女宫颈癌和乳腺癌制度化筛查模式进行思考。

2007—2014年神经管缺陷发生率及其干预效果研究

目的描述2007--2014年神经管缺陷变化趋势，评价一、二级预防出生缺陷干预效果。方法利用2007—2014年辽宁省出生缺陷监测网收集到的资料，调查对象为孕28周至产后7d住院分娩的围产儿及孕28周前出生缺陷儿。结果共收集围产儿i129373例，围产期神经管缺陷JL365例，孕28周前神经管缺陷1147例；围产期神经管缺陷发生率和实际神经管出生缺陷发生率分别为3．2／万和13．4／万。无论是围产期神经管缺陷发生率，还是实际神经管缺陷发生率，均呈逐年下降趋势。结论辽宁省围产期神经管缺陷发生率接近发达国家水平；增补小剂量叶酸以及孕中期超声筛查等一、二级干预措施是降低神经管缺陷发生率、提高出生人口素质的有效措施。

神经管缺陷发生率及一二级干预措施对其影响

目的:了解神经管缺陷变化趋势,评价一二级预防出生缺陷干预效果。方法:利用1996～2011年辽宁省出生缺陷监测网收集到的资料,调查对象为孕28周～产后7天住院分娩的围产儿及孕28周前出生缺陷儿。结果:共收集围产儿1 292 669例,围产期神经管缺陷儿983例,2011年孕28周前神经管缺陷140例;围产儿总神经管缺陷发生率为7.60/万,呈逐年下降趋势。1996～2009年农村神经管缺陷发生率高于城镇,是城镇的2.23倍;2010～2011年城乡神经管缺陷发生率无明显差异。2011年无脑畸形、脊柱裂和脑膨出3种畸形经超声产前诊断并终止妊娠的平均孕周分别为19.8、25.9和21.5周;2011年186例神经管缺陷,140例在孕28周前诊断并终止妊娠(占75.27%),早期新生儿中的神经管缺陷11例,仅占5.91%。结论:辽宁省超声产前诊断水平显著提高,达到发达国家水平;增补小剂量叶酸以及孕中期超声筛查等一二级干预措施是降低神经管缺陷发生率、提高城市人口素质的有效途径。

猪NLRP3单克隆抗体制备及其抗原表位的鉴定

为制备猪炎症小体NLRP3的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NLRP3作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选获得了3株能稳定分泌NLRP3蛋白的杂交瘤细胞株9H5、13E1、15E2,鉴定了抗体亚类,将目的蛋白逐步截短后鉴定出了单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,MAb 9H5和15E2识别的抗原表位序列在1~57 aa之间,MAb 13E1识别的表位序列在115~186 aa之间。免疫荧光、Western blot和亚类鉴定试验显示,杂交瘤细胞产生的抗体均可与NLRP3及重组蛋白特异性结合,9H5、13E1、15E2的重链亚型均为IgG 2b,轻链分别为λ、λ和κ链。本研究成功制备了猪NLRP3的单克隆抗体,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的功能提供工具。