姜黄素对HepG2细胞固醇调控元件结合蛋白-2表达的影响

目的研究姜黄素对人肝癌细胞株(Human hepatocellular liver carcinoma cell line,HepG2)固醇调控元件结合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)基因表达的影响,从信号调控通路水平进一步探讨姜黄素的降胆固醇作用机理。方法分别利用蛋白免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reactionm,PCR)技术研究姜黄素对HepG2细胞SREBP-2核片段碱性螺旋-环-螺旋蛋白(basic helix-loop-helix protein,bHLH)表达及SREBP-2 mRNA的影响。结果20 mol/L姜黄素可以促进HepG2细胞SREBP-2核片段bHLH增多,而对SREBP-2mRNA表达无影响。结论姜黄素可以通过促进HepG2细胞SREBP-2核片段bHLH的增多,上调低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)的表达,起到降低血清胆固醇的作用。

发色基团辅助激光失活技术的研究方法及其应用进展

发色基团辅助激光失活(CALI)技术通过目标蛋白与能够吸收光能量继而产生大量氧自由基的荧光基团相结合,以干扰目标蛋白的功能.该技术始于20世纪80年代,目前已经发展出很多新的方法,对许多生命科学领域的研究起到了重要的推动作用.本文结合国内外最新的研究进展,针对CALI的作用原理、技术方法和实际运用等方面进行简要综述,并展望其在临床上的潜在应用价值.

应用免疫磁珠捕获技术分析宿主细胞蛋白抗体覆盖率

目的:建立并应用基于免疫磁珠捕获分离(immunomagnetic beads separation,IMBS)技术的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)抗体覆盖率分析方法。方法:首先,建立和优化IMBS方法,包括HCP抗体磁珠偶联、洗涤和洗脱条件关键步骤。其次,针对二维电泳实验部分,设计等电聚焦质控和银染质控,并建立IMBS处理后的样品前处理方法,可用于LC⁃MS/MS分析,计算HCP抗体覆盖率。结果:优化确定IMBS覆盖率方法步骤,相对0.5 mg抗体,采用500μL磁珠偶联使HCP抗体的捕获效率最高,通过8次洗涤消除非特异性结合HCP,3次洗脱步骤充分收获结合的HCP。开发基于荧光标记多肽的2种等电聚焦质控品和银染灵敏度质控品,可以有效监控二维电泳实验过程。MS法具有较高的分辨率和测量精度,采用IMBS结合MS法可以识别到更多的HCPs,表现出来的覆盖率也高于IMBS结合二维电泳的方法;同时,IMBS结合MS法还可以通过识别高风险HCPs评估抗体的性能。结论:本研究建立稳定可靠的IMBS⁃2DE方法和IMBS⁃LC/MS/MS方法用于分析HCP抗体覆盖率,2个技术平台获得的抗体覆盖率水平由于分析灵敏度的不同导致结果有较大的差异。

建立CAR-T细胞治疗产品质量控制检测方法及其定量参考品的数字PCR方法研究

目的:本研究建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗产品质量控制中猿猴病毒40大T抗原(SV40LTA),腺病毒早期区域1A蛋白(E1A)和质粒残留水平的荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法,同时采用微流控芯片式数字PCR技术对质粒定量参考品进行赋值。方法:通过建立多重荧光定量PCR的方法,在一个反应中同时检测SV40LTA和E1A的残留水平。针对目前慢病毒等包装技术存在多种质粒组合系统(如四质粒和五质粒),对质粒的残留检测标准难以统一,本研究从同源性很高的复制子区域入手,设计和筛选引物探针,能同时检测多种不同质粒的总体残留水平。建立数字PCR技术分别对SV40LTA和E1A的质粒定量参考品拷贝数浓度标定方法进行方法学验证和赋值。结果:SV40LTA和E1A双重定量PCR方法的特异性好,最低定量限分别达到2.80×10和2.98×10 copies·μL^(-1)。质粒残留检测法的最低定量限可达到2.80×10 copies·μL^(-1)。通过采用目前快速发展的数字PCR技术进行赋值,经典吸光度法计算质粒定量参考品SV40LTA和E1A的拷贝数浓度为2.80×10^(8)和2.98×10^(8) copies·μL^(-1);经数字PCR标定分别为1.06×10^(8)和1.21×10^(8) copies·μL^(-1)。结论:本研究建立的SV40LTA,E1A和质粒检测方法灵敏度较高、特异性强,能满足CAR-T细胞治疗产品的质量控制要求。经典的吸光度法定值的结果大于数字PCR方法,大约有2倍左右的差别。