猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。

奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定

本试验旨在培养功能性奶牛乳腺上皮细胞系,为奶牛泌乳调控和奶牛乳房炎发病机制研究提供功能性的细胞模型。采用组织块细胞培养法来分离纯化并鉴定奶牛乳腺上皮细胞;采用有限稀释法单克隆奶牛乳腺上皮细胞;采用噻唑蓝（MTT）法来分析奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线是否为正常的＂S＂形;观察细胞角蛋白18免疫荧光来证明所培养的细胞为上皮型;选择培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞进行染色体核型分析。结果表明：1）利用组织块细胞分离法能够成功获得奶牛乳腺上皮细胞并传至20代。2）培养5~6 d成纤维细胞迅速增殖且周围分裂出少量的上皮细胞。培养8 d奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖,形成岛屿状集落,呈单层＂鹅卵石＂和＂铺路石＂形态生长。3）奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性。4）培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为60条,具有正常的细胞二倍体核型。综上所述,采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞,但不是永生化细胞。

黄花草木樨水浸液中香豆素的含量及其对7种植物种子萌发和幼苗生长的影响

本研究旨在明确化感物质香豆素在黄花草木樨(Melilotus officinalis)水浸提液中的含量,并验证其化感抑草潜力。试验采用液质联用(LC/MS)测定了黄花草木樨水浸提液中的香豆素含量,并采用生物检测测定了不同浓度香豆素溶液对多花黑麦草(Lolium multiflorum)、籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)、稗草(Echinochloa crus-galli)、萹蓄(Polygonum aviculare)、紫花苜蓿(Medicago sativa"Victoria")、红三叶(Trifolium pratense)、黄花草木樨的种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明,黄花草木樨水浸提液中香豆素的含量为46.78μg·m L-1,占水浸提液干物质总量的1.152%;香豆素在40μg·m L-1时能显著抑制多花黑麦草、萹蓄、红三叶、紫花苜蓿的种子萌发和幼苗生长(P<0.05),香豆素浓度在80μg·m L-1时,除了对籽粒苋的种子萌发表现出促进作用外,对其余供试植物的种子萌发和幼苗生长均有显著的抑制作用(P<0.05),对黑麦草、萹蓄和红三叶的种子萌发和幼苗生长表现为完全抑制。香豆素在黄花草木樨水浸提液中的含量较高,香豆素对多花黑麦草、稗草、萹蓄、红三叶、紫花苜蓿、黄花草木樨等植物具有很强的化感抑制作用,其对不同植物的化感作用方式和作用强度有较大差异。

鸡胚小肠上皮细胞的体外分离培养和鉴定

本试验旨在提供鸡小肠上皮细胞的体外分离方法,为进一步研究鸡肠道疾病的致病机理、鸡肠道营养物质转运吸收与免疫机理提供模型。本试验采用组织块培养法来分离培养鸡小肠上皮细胞。运用刮除法、酶消化法、有限稀释法纯化鸡小肠上皮细胞。利用噻唑蓝(MTT)法来鉴定鸡小肠上皮细胞生长情况。通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测鸡小肠上皮细胞特异性基因的表达来鉴定鸡小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块细胞培养法能够成功获得鸡小肠上皮细胞系。2)接种组织块8h内鸡小肠上皮细胞开始大量增殖。3)鸡小肠上皮细胞的生长曲线为"S"形,符合细胞增殖规律。4)传至第5代的鸡小肠上皮细胞体积开始变大,细胞形态模糊并开始衰老凋亡;细胞传代时进行接种,大量的细胞未贴壁。综上所述,采用在6孔板内接种鸡小肠组织快,能够获得具有稳定性的鸡小肠上皮细胞,为鸡肠道疾病致病机理、鸡肠道营养物质转运吸收和永生化鸡小肠上皮细胞提供细胞素材。

响应面法优化玉米秸秆饲料的蒸汽爆破加工工艺

为了确定蒸汽爆破预处理玉米秸秆饲料的最优反应条件,以汽爆玉米秸秆还原糖得率为指标,根据BoxBehnken试验设计原理,分析了蒸汽压强、维压时间和预浸水分含量对玉米秸秆还原糖得率的影响,并建立了数学模型。结果表明:蒸汽压强和维压时间对汽爆玉米秸秆水解还原糖得率有显著影响(P<0.01),水分预浸增强了秸秆预处理效果。在考虑实际生产与汽爆后秸秆饲料感官特性前提下,最优汽爆条件为蒸汽压强2.2 MPa,维压时间200 s,预浸水分含量10%的条件下,汽爆玉米秸秆的还原糖得率可达4.33%。

不同培养模式下奶牛乳腺上皮细胞形态及酪蛋白表达的差异

本试验旨在研究二维和三维培养模式下奶牛乳腺上皮细胞形态及酪蛋白表达的差异。利用组织块培养细胞来分离奶牛乳腺上皮细胞,利用有限稀释法克隆奶牛乳腺上皮细胞。通过显微镜观察细胞在基质胶中的形态,并用Western blot法检测酪蛋白的诱导表达。结果表明:1)采用组织块培养细胞能够成功分离奶牛乳腺上皮细胞,克隆得到的细胞能稳定传至20代。2)细胞接种12h之后,二维培养的奶牛乳腺上皮细胞并没有形成明显的细胞簇,细胞间也没有相互连接;三维培养的奶牛乳腺上皮细胞形成明显的细胞簇,在基质胶内的层黏连蛋白作用下形成交织网状结构。培养2d细胞间交织网状结构逐渐消失,细胞开始形成单个的成细胞簇,使细胞间更加紧密的相连。3)二维培养奶牛乳腺上皮细胞不能诱导表达酪蛋白,但三维培养细胞可诱导表达κ-酪蛋白。综上所述,三维培养奶牛乳腺上皮细胞能够改变细胞的形态和功能,诱导κ-酪蛋白的表达,三维培养的奶牛乳腺上皮细胞可作为奶牛的泌乳机制研究的体外模型。

短链脂肪酸对奶牛瘤胃上皮细胞的炎性细胞因子和G-蛋白偶联受体41表达的影响

本试验旨在研究不同浓度短链脂肪酸(SCFA)对奶牛瘤胃上皮细胞的炎性细胞因子和G-蛋白偶联受体41(G PR41)表达的影响。试验分为4组,每组3个重复,分别用5、10、20和40 mmol/L的SCFA培养奶牛瘤胃上皮细胞24 h,收集细胞提取总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对炎性细胞因子、趋化因子和G PR41表达量进行测定。结果表明:添加20和40 mmol/L SCFA条件下,G PR41表达量显著高于添加5 mmol/L SCFA (P <0.05);与添加5和10 mmol/L SCFA相比,添加20和40 mmol/L SCFA显著加强了白细胞介素-1β(IL-1β)表达量(P<0.05);与添加5 mmol/L SCFA相比,添加10、20和40 mmol/L SCFA显著加强肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达量(P <0. 05);此外,添加5、10和20 mmol/L SCFA之间的趋化因子20(CCL20)表达量差异不显著(P>0.05),然而,添加40 mmol/L SCFA条件下,CCL20的表达量显著上调(P<0.05);与添加5和10 mmol/L SCFA相比,添加20和40 mmol/L SCFA显著加强趋化因子2(CXCL2)和趋化因子8(CXCL8)表达量(P<0.05);随着SCFA浓度逐渐上升,趋化因子3(CXCL3)表达量显著上调(P<0.05)。综上所述,SCFA诱导GPR41表达,从而介导炎性细胞因子以及趋化因子的表达上调,介导瘤胃上皮保护性免疫反应。

N-羟甲基蛋氨酸钙水平对泌乳奶牛生产性能、瘤胃发酵和营养物质消化的影响

为研究不同水平N-羟甲基蛋氨酸钙(n-Hydroxymethyl methionine calcium,N-HMM-Ca)对泌乳期荷斯坦奶牛生产性能、乳品质及瘤胃发酵的影响。选用胎次、产奶量、泌乳天数相近的30头健康荷斯坦奶牛,采用完全随机区组设计,分为5组,每组6头,分别在日粮中以干物质基础添加0、0.15%、0.30%、0.75%、1.50%N-HMM-Ca。预试期14 d,正试期42 d。结果表明:1)日粮中添加0.15%N-HMM-Ca能显著提高奶牛产奶量(P<0.05);2)与无添加对照组相比,0.15%~0.75%组乳糖率、乳蛋白率均显著提高(P<0.05);3)日粮中添加不同水平N-HMM-Ca对粗蛋白质、粗脂肪、钙、磷的表观消化率无显著影响,但0.15%组能显著提高中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)的表观消化率(P<0.05);4)N-HMM-Ca的添加水平不会对瘤胃液pH、挥发性脂肪酸及微生物蛋白含量造成显著影响(P>0.05);5)0.15%组能够提高产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes、F.succinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus、R.albus)和黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens、R.flavefaciens)的相对表达量(P<0.05)。综上所述,泌乳奶牛日粮中添加0.15%N-HMM-Ca能有效提高生产性能以及乳品质,提高饲料的消化利用率。因此,建议在泌乳奶牛日粮中添加N-HMM-Ca的适宜剂量为0.15%。

日粮中能量和蛋白质水平对幼龄反刍动物生长发育影响的研究进展

幼龄反刍动物处于十分重要的生长阶段,连同后续阶段均会对其成年后的总体发育水平、组织器官成熟、免疫系统快速构建、泌乳以及繁殖等性能造成影响。开食料的采食、饮水量以及断奶后日粮的营养成分等都会对幼龄反刍动物的瘤胃发育产生客观作用。日粮营养水平会反映在动物代谢情况上,并对其生长性能产生一定作用,并且还会改变机体激素和生长因子情况反映于其生长发育情况。而影响幼龄反刍动物生长发育速度和瘤胃发育程度的重要因素取决于日粮中的能量和蛋白质水平。科学调整能量水平,能够有效增加其断奶期的采食量;确保蛋白质饱和也能够给瘤胃微生态带来必需的氮,由此促进反刍动物消化情况的有效改善,避免出现营养不良等。但是由于试验日粮来源、试验动物品种及试验时期所遇到的各个问题不同,所导致的结果都会不同。因此,文章重点阐述了近些年来日粮中不同能量和蛋白质水平对幼龄反刍动物生长性能和瘤胃发育程度的影响,以期为我国相关日粮配制工作带来一些积极的参考。

饲料中添加N-羟甲基蛋氨酸钙对泌乳期奶牛血清生化指标的影响

为研究饲料中添加不同比例N-HMM-Ca对泌乳期奶牛血清生化指标的影响,试验选用胎次、产奶量和泌乳天数相近身体健康的荷斯坦奶牛30头,完全随机区组分为5组,每组6头。对照组饲喂基础日粮;试验组分别饲喂在基础日粮中以干物质基础添加0.15%、0.30%、0.75%和1.50%的N-HMM-Ca,预试期14d,正试期42d。结果表明:1)泌乳期奶牛日粮中添加0.75%N-HMM-Ca使血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)浓度显著升高。2)在第14天时,1.50%组甘油三酯(TG)浓度显著高于其他各处理组(P<0.01)。血清中高密度脂蛋白(HDL)水平有所提高,但差异不显著(P>0.05);随着N-HMM-Ca添加量的增加血清中非酯化脂肪酸(NEFA)的浓度逐渐降低(P<0.05);对β-羟丁酸(β-OHB)来说,随着日粮中N-HMM-Ca添加量的增加浓度逐渐升高(P<0.05)。3)0.15%、0.30%和0.75%组血清IgA浓度呈现增加的趋势,而且在第42天时尤为显著(P<0.01)。4)在第28天时,泌乳期奶牛日粮中分别添加0.15%和0.30%的N-HMM-Ca使过氧化氢酶(CAT)浓度显著高于其他各处理组(P<0.01)。综上所述,泌乳期奶牛日粮中添加0.15%的N-HMM-Ca有利于改善机体健康。

不同pH和SCFAs对奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs转运蛋白和GPR41表达的影响

为研究不同pH和短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs转运蛋白和G-蛋白偶联受体41(GPR41)表达影响,设计6组试验,每组3个重复,培养24h之后,收集细胞提取细胞总RNA。结果表明:在添加SCFAs条件下,pH 6.2、6.8和7.4之间的MCT1表达量差异不显著(P>0.05);pH 6.8且添加SCFAs条件下,MCT1的表达量显著高于缺乏SCFAs pH 6.8和7.4试验组(P<0.05);pH 6.2的MCT4的表达量显著高于pH 6.8和7.4(P<0.01),MCT4的表达量显著高于缺乏SCFAs(P<0.01),NHE1、NHE2和NHE3表达量显著高于缺乏SCFAs时的表达量(P<0.01);随着pH的降低,NHE1、NHE2和NHE3的表达量逐渐上调,而在缺乏SCFAs条件下,GPR41不表达;在添加SCFAs之后,显著激活了GPR41的表达。研究发现SCFAs能够显著加强奶牛瘤胃上皮细胞SCFAs转运蛋白和GPR41的表达量,从而证明细胞对SCFAs的吸收主要依赖于SCFAs转运蛋白和GPR41。

不同蛋白水平日粮对荷斯坦公犊牛糖异生的影响

为探究不同蛋白水平日粮对荷斯坦公犊牛糖异生的影响,选取年龄和生理状态相似的10头荷斯坦公犊牛(平均为5月龄,体重(172.80±7.16)kg),随机分为2组,每组5头,分别饲喂粗蛋白水平为15.05%和21.02%的颗粒料日粮,预试期7d,正试期56d。通过葡萄糖试剂盒测定血清和肝脏葡萄糖含量,液相色谱测定氨基酸含量,qRT-PCR分析肝脏糖异生途径关键基因的mRNA表达量。结果表明,与低蛋白水平组(15.05%)相比,日粮中高蛋白水平组(21.02%)显著提高血清和肝脏中葡萄糖含量(P<0.05),且显著提高Gly、Asp、Ala、Ser、Leu、Lys、Phe、Ile、Val、Tyr、Pro、Arg、Glu和His的含量(P<0.05),且显著提高了(P<0.05)PCK1、PCK2、PC和PGC1A的mRNA表达量。综上所述,日粮中高蛋白水平(21.02%)可增加肝脏中氨基酸的含量以及糖异生途径关键基因的mRNA表达,进而加快葡萄糖的生成,进一步为犊牛提供能量。