心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型建立及验证

目的建立一种心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型并进行验证。方法采用改良后的重叠延伸PCR法从小鼠基因组中获取目的基因Hotair,构建过表达Hotair的慢病毒质粒,并采用高分子聚合物转染法进行包装及浓缩纯化,测序结果显示构建的慢病毒质粒Hotair序列正确。将18只P0期(出生24 h内)小鼠随机分为Hotair过表达组、阴性对照组、空白对照组,每组6只。Hotair过表达组于左侧胸腔第五肋间隙注射浓缩后的Hotair慢病毒10μL,阴性对照组和空白对照组分别注射等量空载病毒和生理盐水;各组注射4 d后处死小鼠,取心脏组织。采用实时定量荧光PCR法检测Hotair及受Hotair协同调控的赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)mRNA表达,Western blotting法检测LSD1调控的下游蛋白即组蛋白H3二甲基化的赖氨酸4(H3K4me2)表达。结果Hotair过表达组心肌组织Hotair表达高于阴性对照组和空白对照组,H3K4me2蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.01)。Hotair过表达组与阴性对照组心肌组织LSD1 mRNA相对比表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功应用慢病毒载体建立心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型;该模型构建方法简便快捷、Hotair过表达效果明显,为后续研究Hotair参与心脏疾病的相关机制提供了可靠的动物模型。

木兰花碱减轻慢性应激小鼠抑郁样行为及对脑部LSD1组蛋白修饰的影响

目的探索木兰花碱对慢性不可预见性温和应激所致抑郁小鼠行为学的影响机制。方法将ICR小鼠随机分为正常对照组(control组)、抑郁模型组(PG组)、木兰花碱高剂量组(MH组)和木兰花碱低剂量组(ML组)。采用慢性不可预见性温和刺激方法建立抑郁小鼠模型,检测各组小鼠行为学的变化,并用实时定量PCR、Western blot检测小鼠脑部赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)mRNA及蛋白表达水平的变化。免疫组化染色法检测小鼠脑部LSD1阳性细胞数量。结果木兰花碱在行为学上改善了小鼠的抑郁状况,与PG组相比,MH组和ML组悬尾不动时间、强迫游泳不动时间明显缩短(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot结果显示,与control组相比,PG组LSD1mRNA表达差异无统计学意义,蛋白表达明显降低(P<0.05),ML组LSD1 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05);与PG组相比,ML组LSD1 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。免疫组化结果显示,与control组相比,PG组小鼠脑部LSD1阳性细胞数量减少,而ML组较PG组增加。结论在木兰花碱治疗抑郁小鼠的过程中,LSD1可能起到了重要的调节作用。

心肌肥厚大鼠心肌组织及肥大心肌细胞中环状RNA rno_circRNA_016002表达观察

目的观察心肌肥厚大鼠心肌组织及肥大心肌细胞中环状RNA rno_circRNA_016002的表达变化,并探讨其在心肌肥厚过程中的作用。方法将12只SD大鼠随机分为Control组与异丙肾上腺素(ISO)组,每组6只。ISO组每天腹腔注射ISO 3 mg/kg,Control组注射同等体积的生理盐水,连续注射两周后采用心脏超声检测心肌以明确心肌肥厚大鼠模型建立,然后处死大鼠,取出心脏组织,利用实时定量PCR法检测心肌组织中环状RNA rno_circRNA_016002。将心肌细胞H9C2饥饿过夜后分为ISO 50μmol/L与ISO 100μmol/L组、细胞对照组,ISO 50μmol/L与ISO 100μmol/L组中分别添加50与100μmol/L的ISO进行心肌肥厚的诱导,细胞对照组不作处理,利用实时定量PCR法检测肥大心肌细胞H9C2中环状RNA rno_circRNA_016002;将心肌细胞H9C2分为siRNA+ISO 50μmol/L组、siRNA+ISO 100μmol/L组、siRNA组、阴性对照组,其中siRNA+ISO 50μmol/L与siRNA+ISO 100μmol/L组加入siRNA与转染试剂后,分别再加入50与100μmol/L的ISO处理饥饿过夜;阴性对照组中只加入转染试剂,siRNA组中加入siRNA与转染试剂。加入ISO 48 h后利用实时定量PCR法检测各组心肌细胞H9C2中ANP mRNA与BNP mRNA,采用Western blotting检测各组心肌细胞H9C2中ANP、BNP蛋白质。结果与Control组比较,ISO组环状RNA rno_circRNA_016002的表达水平上调(P<0.01);与细胞对照组比较,ISO 50μmol/L、ISO 100μmol/L组环状RNA rno_circRNA_016002的表达水平均上调(P均<0.01)。siRNA+ISO 50μmol/L与siRNA+ISO 100μmol/L组中ANP、BNP mRNA和蛋白质表达与阴性对照组相比,P均>0.05。结论rno_circRNA_016002在ISO诱导的大鼠肥厚的心肌组织和肥大心肌细胞中表达均上调,并且促进了心肌肥厚。

芫花素对于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响

目的探索芫花素对于MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响。方法采用芫花素1、5、10、15μmol/L处理MC3T3-E1细胞14 d,采用MTS法检测芫花素对MC3T3-E1细胞增殖的抑制作用;实时定量PCR和Western blotting法检测测芫花素对MC3T3-E1细胞中ALP、HDAC1和Runx2 m RNA和蛋白表达的影响。结果芫花素5、10、15μmol/L可以显著促进MC3T3-E1细胞中ALP、Runx2 m RNA和蛋白表达水平的提高(P<0.05),HDAC1 m RNA和蛋白表达水平的下调(P<0.05),表明芫花素可以促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。结论芫花素具有促进MC3T3-E1细胞可以促进成骨细胞分化,对成骨细胞的分化过程有一定的调节作用。

LSD1过表达及去甲基化作用缺失质粒的构建与鉴定

目的 评估赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒在人胚肾细胞HEK293T中的表达水平。方法 采用PCR扩增LSD1片段，重叠PCR扩增LSD1去甲基化作用缺失片段，构建大鼠特异性LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒，并经琼脂糖凝胶电泳和测序进行验证。将验证后的两种重组质粒与空白载体分别进行包病毒，感染HEK293T后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞，再用Western Blot和实时定量PCR检测稳定表达的HEK293T细胞内LSD1的表达情况。结果 琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明，LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒构建成功。Western Blot和实时定量PCR检测结果显示，与空白对照组相比，LSD1过表达组和LSD1去甲基化片段缺失组HEK293T细胞中LSD1蛋白及mRNA的相对表达量均上调，差异均具有统计学意义（均P〈0.01）。结论 构建的LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒在HEK293T细胞中实现了LSD1基因的过表达，为进一步研究LSD1基因与相关疾病的关系以及LSD1去甲基化作用奠定了基础。

采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建

目的构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T,避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应。方法根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒],再将这两个质粒共转染HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况。结果实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较,共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18,均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05,均P<0.01),EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16,均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06,均P<0.01)。该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中,并干扰了EZH2的表达。结论采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系。

烷化甘油磷酸合酶在异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚中的作用

目的探讨烷化甘油磷酸合酶(AGPS)在异丙肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心肌肥厚过程中的作用.方法采用ISO腹腔注射法构建大鼠病理性心肌肥厚模型.选取健康Sprague-Dawley大鼠(120~150 g)12只,采用抽签法将大鼠随机分为ISO处理组和正常对照组,每组6只.ISO处理组大鼠每天腹腔注射ISO(3 mg/kg),正常对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水,连续注射2周.通过超声心动检测大鼠左室舒张期内径、左室后壁厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率和左室质量的变化,苏木素-伊红染色检测大鼠心肌细胞横截面积的大小,蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测大鼠心肌组织中3种肥厚因子[心房利钠肽(ANP)、肌球蛋白轻链-2V(MLC-2V)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)]和AGPS的mRNA和蛋白表达.结果超声心动检测结果表明大鼠心肌肥厚模型构建成功.苏木素-伊红染色结果显示,ISO处理组大鼠心肌横截面积明显大于正常对照组.蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR结果表明:与正常对照组相比,ISO处理组大鼠心肌组织中3种肥厚因子及AGPS的mRNA和蛋白相对表达量均上调,差异均具有统计学意义(均P<0.05).结论构建的大鼠病理性心肌肥厚模型中AGPS表达上调,为进一步研究AGPS在病理性心肌肥厚发病机制中的作用提供了理论依据.