微嗜酸寡养单胞菌中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox生物学功能研究

【目的】研究微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox(phosphopyridoxamine oxidase,pnpox)在维生素B6(VB6)合成中的贡献及对黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的降解活性。【方法】采用基因插入突变方式,对菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶基因pnpox进行突变,得到突变菌株。通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测突变株对AFB1的降解活性,以及突变株中吡哆醇和吡哆醛的合成情况,确定基因pnpox在寡养单胞菌体内VB6合成中的贡献和黄曲霉毒素降解代谢作用。【结果】成功构建了磷酸吡哆胺氧化酶基因突变子pnpox::pK19mobΩ2HMB,突变子吡哆醛的合成量较野生型菌株显著减少,吡哆醇合成量与野生型菌株无显著性差异;同时,突变子与野生型株CW117对AFB1的降解活性未发现显著性差异。【结论】菌株CW117中磷酸吡哆胺氧化酶在吡哆醛合成的过程中起着重要作用,该基因突变会导致VB6的严重缺乏,影响寡养单胞菌正常生长,但该基因对CW117降解黄曲霉毒素无显著性贡献。

微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对黄曲霉毒素B1降解脱毒的生物活性

【目的】探究微嗜酸寡养单胞菌中的漆酶对AFB1的降解活性,并确定漆酶在菌株CW117降解代谢AFB1过程中的贡献。【方法】从微嗜酸寡养单胞菌基因组中,共筛选到两个漆酶基因lc1和lc2,并用大肠杆菌BL21外源表达蛋白rLC1和rLC2,在体外检测其对AFB1的降解活性。同时参考前人报道,研究了氧化性辅剂对漆酶AFB1降解的促进作用。在体外实验基础上,利用自杀质粒pK18mobsacB,以同源重组方法构建了两株漆酶缺失株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2,验证了漆酶基因(lc1和lc2)对AFB1体内降解作用。【结果】体外实验显示,重组酶rLC1具有AFB1降解活性,氧化性辅剂ABTS、AS或SA可显著地提高rLC1降解活性,但rLC2未显示降解活性。突变株CW117Δlc1和CW117Δlc1-lc2对AFB1仍显示了较高的降解活性,且在大多数降解时间点与野生株CW117无显著差异。【结论】微嗜酸寡养单胞菌CW117菌株中,LC1在体外显示了AFB1的降解活性,且降解活性可以被氧化性辅助因子增强,LC2未显示体外降解活性;体内试验发现,漆酶基因lc1和lc2对菌株CW117降解AFB1的贡献较小,该菌株还存在其他降解途径。