小鼠Binlb基因的抗菌活性研究及其转基因小鼠的建立

我们在真核细胞中表达了小鼠Binlb基因,证实了它的抗菌活性,并进一步证明了该蛋白C端融合HA抗原决定簇后基本不影响蛋白的生物活性,为开展这一蛋白的转基因小鼠工作提供了较理想的转基因材料。同时我们利用四环素调控的基因表达系统(Tet-on系统)分别建立了附睾专一性表达rtTA的转基因小鼠和由TRE控制的mBinlb-HA的转基因阳性小鼠。这项研究对于我们理解mBinlb在体内的生理和病理作用提供了进一步研究的基础。

人β防御素在牙髓组织中的表达及与炎症因子的关系

目的:探讨人β防御素(humanβ-defensin,HBD)家族成员在人牙髓组织中的表达,以HBD2为代表,探讨HBD在牙髓炎症反应中所受调控及HBD家族成员之间的调节关系。方法:在NCBI GEO Profiles数据库中检索HBD在人牙髓组织中表达的基因芯片信息,并运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行验证。运用4种炎症因子TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6不同组合刺激人牙髓细胞,采用实时荧光定量核酸扩增检测法(qPCR)检测相应组分对HBD2表达水平的影响;HBD110预处理及LPS刺激牙髓细胞后,采用qPCR方法检测TNF-α、IL-1α和HBD2的表达水平。采用GraphPad Prism 5.01对实验组和对照组的结果进行统计学分析。结果:在NCBI GEO Profiles数据库中检索到27种HBD家族成员在人牙髓组织中表达。TNF-α、IL-1α、IL-1β和IL-6联合作用,可显著提升HBD2的表达水平。HBD110通过调控TNF-α和IL-1α的表达,提高HBD2的表达水平。结论:除已有报道的HBD1、HBD2、HBD3和HBD4外,其他HBD家族成员在人牙髓组织中表达,且HBD2在牙髓组织中受炎症因子及其他HBD家族成员的调控。

RNA干扰-转录后水平的基因沉默

随着人类基因组计划的初步完成,生命科学也随之进入后基因组计划的时代。在各种研究基因功能的方法中,RNA水平使目的基因沉默无疑是目前研究的新点和热点,特别是双链RNA(dsRNA)介导的转录后水平的基因沉默(PTGS),更是快速关闭基因的途径,目前在植物、线虫、果蝇和小鼠早期胚胎中均有发现和证实。这一现象的发现和应用将有助于基因功能及其在信号传导、病毒抵御机制等方面的研究,并有可能开创基因治疗的新模式。

绝缘子元件的克隆及功能验证

目的:克隆绝缘子元件并验证其绝缘功能,为转基因载体的构建提供条件。方法:以GenBank提供的绝缘子序列设计引物,应用PCR方法,从鸡的基因组序列中克隆绝缘子,酶切、测序鉴定;将绝缘子亚克隆至表达载体pEGFP-N2,体外扩增纯化后瞬时转染COS7细胞,72h后收获细胞,荧光显微镜下观察EGFP表达情况。结果:绝缘子元件成功克隆,酶切、测序鉴定序列正确;体外试验证实,亚克隆有绝缘子的载体与对照组比较,EGFP表达水平显著降低。结论:绝缘子元件成功克隆,且在体外具有绝缘功能,能够与目的基因共同构建转基因载体,从而提高转基因的表达效率。

条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型,为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件;构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒,并将其调控元件和受控元件串联成一个载体,在两元件之间插入绝缘子,以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率,在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件;将MT基因亚克隆至此载体;转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录PCR验证后,将其在体外扩增、酶切、回收,行小鼠受精卵原核注射,获得转染MT基因阳性小鼠;强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达,使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆;成功构建条件化转基因载体;体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控;通过原核注射,获得5只转基因阳性鼠;2只行体外诱导2月后,1只出现血管瘤表型,逆转录PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建,此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。

小鼠生长激素促分泌素受体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠生长激素促分泌素受体(GHS-R)真核表达系统,并观察其在瞬时转染的COS-7细胞系中的表达情况。方法以小鼠基因组为模板,通过拼接PCR技术(SOE-PCR)克隆出GHS-R的编码序列(CDS),插入真核表达载体pcDNA3中,构建重组真核表达质粒pcDNA3-GHS-R,酶切鉴定并测序,瞬时转染COS-7细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果成功扩增了小鼠GHS-R编码序列(CDS),酶切和测序证明pcDNA3-GHS-R构建正确,Western Blot方法证实转染的该质粒能在COS-7细胞中正确表达目的蛋白。结论成功构建了小鼠GHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。