敲低TPX2对猪卵母细胞纺锤体组装及凋亡的影响

[目的]本研究旨在探究Xklp2靶蛋白(TPX2)在猪卵母细胞减数分裂过程中的表达定位及其潜在功能。[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(COC)并随机分组后进行体外成熟培养,通过间接免疫荧光染色与蛋白免疫印迹等方法检测TPX2在卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位与动态表达情况;通过生发泡期(germinal vesicle, GV)显微注射特异性siRNA以敲低TPX2,研究其对卵母细胞减数分裂进程、纺锤体结构以及早期凋亡的影响。[结果]TPX2在第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)表达量显著上升,其亚细胞定位与α-微管蛋白(α-tubulin)的分布特点相似,并主要富集在纺锤体两极。TPX2被敲低后卵母细胞第一极体(PB1)排出率显著下降(P<0.05),且大多数细胞被阻滞在生发泡破裂期(GVBD)和第一次减数分裂后末期(ATⅠ),同时纺锤体结构异常比例显著升高(P<0.05),并伴随染色体排列紊乱。与对照组相比,敲低TPX2后卵母细胞早期凋亡率急剧增加(P<0.05),凋亡相关基因Caspase 3表达量以及Bax/Bcl2值显著升高(P<0.05)。[结论]TPX2与猪卵母细胞减数分裂过程中的纺锤体组装及细胞周期调控密切相关,敲低TPX2引起卵母细胞纺锤体结构异常,并诱导早期细胞凋亡,最终导致卵母细胞成熟失败。

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

【目的】探究伏马毒素 B_(1)(fumonisin B_(1),FB_(1))对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制, 为临床有效防治FB_(1)所致的生殖毒性损伤提供理论参考。【方法】采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes, COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度 FB_(1)(0、10、20 和 30 μg·mL^(-1))处理 44 h 后,统计卵母细胞第一极体(first polar body, PB1)排出和激活后胚胎发育情况;通过免疫荧光染色结合共聚焦显微镜技术进一步检测 FB_(1)对卵母细胞减数分裂进程和细胞骨架结构的影响;为进一步探究 FB_(1)对猪卵母细胞毒性损伤的作用机制,分别采用 JC-1、Annexin V-FITC和 LC3A/B 荧光染色检测各组卵母细胞内线粒体功能、早期凋亡和自噬水平,并在此基础上,进一步通过 Western blotting分析了凋亡/自噬相关蛋白的表达情况。【结果】FB_(1)处理对卵母细胞成熟具有明显的抑制作用,PB1 排出率呈浓度依赖性下降,当 FB_(1)浓度达到 20 μg·mL^(-1)以上时,PB1 排出率显著降低(P<0.01),并使卵母细胞孤雌激活后胚胎的卵裂率及囊胚率均显著降低(P<0.01),对卵母细胞的发育潜力有一定的损伤作用。细胞周期分析结果表明,FB_(1)处理还会导致减数分裂周期进程紊乱,使阻滞在生发泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD)的卵母细胞比例显著升高(P<0.01)成功发育至第二次减数分裂中期(metaphase II,MII)细胞比例明显下降(P<0.01),同时,卵母细胞中纺锤体异常的比例显著升高(P<0.01)、胞膜上的微丝分布显著减少(P<0.05)。进一步的研究结果表明,与对照组相比,FB_(1)处理组卵母细胞线粒体膜电位明显降低(P<0.05),线粒体功能受损,同时,FB_(1)处理组卵母细胞早期凋亡率显著增加(P<0.01),细胞自噬水平也显著升高(P<0.01)。Western blotting 分析结果显示,FB_(1)处理组卵母细胞中促凋亡蛋白 BAX 和自噬蛋白 LC3A/B II的表达均显著上调(P<0.05),抑凋亡蛋白 BCL2 的表达显著下调(P<0.05),提示早期凋亡和自噬的发生。【结论】FB_(1)对猪卵母细胞体外成熟及其激活后胚胎发育具有明显的毒性损伤作用,致使减数分裂周期阻滞,纺锤体结构紊乱、微丝分布减少和线粒体损伤,其毒性作用机制与诱导卵母细胞凋亡和自噬有关。