STGC3新基因的克隆及功能初步分析

背景与目的:研究显示,染色体3p21是鼻咽癌高频率杂合性丢失位点,本研究在对3p21区域与鼻咽癌相关的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)筛选的基础之上,进行鼻咽癌相关新基因的克隆和功能研究。方法:采用cDNA克隆质粒测序及RACE方法,获取新基因全长cDNA。利用因特网上核酸、蛋白质数据库及蛋白质分析软件进行生物信息学分析。通过构建pEGFP-C2/STGC3绿色荧光表达载体,与脂质体共转染COS7、CNE2细胞,进行基因表达蛋白质定位分析。用Northernblot法检测STGC3在人其他正常组织及肿瘤细胞系表达状况。结果:在3p21区域获得一个全长为1271bp的cDNA新序列,生物信息学分析与已知基因无明显同源性,属于一个新基因,编码146个氨基酸,定位于染色体3p21,被命名为STGC3(GenBank登录号:AY078383)。蛋白质定位分析显示,STGC3融合蛋白存在于细胞浆及细胞核内;MTETMArray2多组织膜Northernblot显示该基因在人正常组织及肿瘤细胞均有表达,并在淋巴瘤等多种肿瘤细胞株中阳性杂交信号弱。结论:STGC3属于一个新基因,其表达的蛋白质存在于细胞浆及细胞核内。在鼻咽癌及多种肿瘤细胞株表达下调。

鼻咽癌中染色体3p21区域一个表达下调的EST的鉴定

背景与目的:研究显示鼻咽癌细胞3p14-25存在高频率杂合性丢失位点。本研究拟寻找与筛选染色体3p21区域与鼻咽癌相关的表达序列标签(expressedsequencetag,EST),为定位候选克隆鼻咽癌相关新基因奠定基础。方法:充分利用网上的生物信息资源,采用定位查找ESTs,对ESTs进行同源性比较分析、筛选;运用逆转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)方法,检测ESTs在鼻咽癌和正常鼻咽组织中的表达;并用Northernblot杂交方法,检测EST在人其他正常组织及肿瘤细胞系的表达状况。结果:在3p21区域筛选到一个在鼻咽癌中表达下调的EST(N31985),在60.00%(3/5)的鼻咽癌细胞株及47.06%(16/34)的鼻咽癌活检组织检测到有EST(N31985)表达下调,与正常鼻咽上皮组织相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:染色体3p21区域EST(N31985)在鼻咽癌中表达下调,提示其可能参与鼻咽癌癌变过程。

胃癌中p16基因表达、缺失及突变的检测

目的:研究p16基因表达与胃癌发生发展、侵袭、转移的关系及p16基因外显子2缺失、突变在胃癌发生中的地位。方法:运用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶SP免疫组织化学方法检测胃癌及癌前病变组织中p16蛋白的表达;采用聚合酶链反应PCR、聚合酶链反应-单链构象多态性PCRSSCP分析方法检测胃癌中p16基因外显子2的缺失、突变。结果:1p16蛋白表达阳性率:①正常胃粘膜96.25%77/80,不典型增生92.00%45/50,胃癌47.54%58/122,胃癌组中p16蛋白表达低于正常胃粘膜及不典型增生(P<0.05);②粘液腺癌10.00%,1/10低于低分化腺癌51.22%,21/41、未分化癌57.69%,15/26和印戒细胞癌62.50%,10/16(P<0.05);③30例原发癌和淋巴结转移癌配对标本中p16蛋白表达阳性率:原发癌46.67%(14/30),淋巴结转移癌16.67%5/30,淋巴结转移癌低于原发癌P<0.05;2p16基因缺失与突变分析:25例胃癌中检测出缺失5例但未发现突变。结论:①p16蛋白表达缺失与胃癌的发生、组织学类型及淋巴结转移有关。②p16基因外显子2缺失可能与胃癌发生有关而p16基因突变可能与胃癌发生无关。

EB病毒与鼻咽癌相关的分子机制研究进展

全文着重讨论EB病毒与鼻咽癌组织学类型及肿瘤细胞表型的关系、肿瘤组织淋巴间质的可能作用。

P16蛋白在胃癌及癌前病变组织中表达的初步分析

目的：研究和分析Ｐ１６蛋白在胃癌及癌前病变（慢性萎缩性胃炎和慢性消化性胃溃疡）中的表达。方法：采用链霉菌抗生物素蛋白——过氧化物酶连接法（Ｓ－Ｐ法），检测了３０例癌前病变，３０例胃癌中Ｐ１６蛋白的表达水平。结果：Ｐ１６蛋白阳性表达：胃癌组织５３．３３％（１６／３０）；癌前病变９０．００％（２７／３０）；对照组正常胃组织９６．６７％（２９／３０）。结论：Ｐ１６蛋白表达，胃癌组与正常对照组及癌前病变组间的差异均有显著性意义（Ｐ＜０．０５），癌前病变组与正常对照组间差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。

P16蛋白表达与胃癌浸润转移关系的研究

采用链霉素抗生素蛋白—过氧化物酶连接法（Ｓ—Ｐ法），研究不同浸润深度胃癌及淋巴结转移性胃癌组织中Ｐ１６蛋白的表达。结果显示，Ｐ１６蛋白阳性表达率，浸润浅肌层胃癌为４８．００％，浸润深肌层及全层胃癌为４７．２２％，差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５）；３０例原发及淋巴结转移性胃癌的配对标本中，原发癌Ｐ１６蛋白表达阳性率为４６．６７％，转移癌为１６．６７％，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。结果提示：Ｐ１６蛋白表达缺失可能与胃癌转移有关。

胃癌及癌前病变中P16蛋白表达的研究

采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连接法（Ｓ－Ｐ法），研究Ｐ１６蛋白在胃癌和癌前病变（不典型增生、慢性萎缩性胃炎及慢性消化性胃溃疡）中的表达。结果显示，Ｐ１６蛋白阳性表达：胃癌４７．５４％（５８／１２２），癌前病变９０．００％（７２／８０），正常胃粘膜９６．２５％（７７／８０），高分化腺癌３７．９３％（１１／２９），低分化腺癌５１．２２％（２１／４１），未分化癌５７．６９％（１５／２６），印戒细胞癌６２．５０％（１０／１６），粘液腺癌１０．００％（１／１０）。经统计学处理，胃癌组与正常对照组及癌前病变组间的差异均有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；粘液腺癌与低分化腺癌、未分化腺癌及印戒细胞癌之间的差异也均有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。

p16蛋白在胃癌及癌前病变中的表达

目的 研究 p16蛋白在胃癌和癌前病变 (不典型增生、慢性萎缩性胃炎及慢性消化性胃溃疡 )中的表达。方法 采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连接法 (S -P)。结果 p16蛋白阳性表达 :胃癌 47.5 4% (5 8/12 2 ) ,癌前病变 90 .0 0 % (72 /80 ) ,正常胃粘膜 96 .2 5 % (77/80 ) ,高分化腺癌 37.93 % (11/2 9) ,低分化腺癌 5 1.2 2 % (2 1/41) ,未分化癌 5 7.6 9% (15 /2 6 ) ,印戒细胞癌 6 2 .5 0 % (10 /16 ) ,粘液腺癌 10 .0 0 % (1/10 )。结论 p16蛋白表达 :胃癌组与正常对照组及癌前病变组间的差异均有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;粘液腺癌与低分化腺癌、未分化腺癌及印戒细胞癌之间的差异也均有显著性意义 (P <0 .0 5 )。

p16/MTS1基因与消化系统肿瘤

肿瘤发生的分子基础是原癌基因的活化或(和)抑癌基因的失活,导致某些细胞分化不良和增殖失控而形成肿瘤。因此,对癌基因和抑癌基因的研究已成为肿瘤研究的中心课题,而且进展十分迅速,现已发现癌基因100多种,抑癌基因10多种。抑癌基因中又以新发现的多种肿瘤抑制基因(Multiple Tumor Suppressor 1,MTS1)更引人注目。 1 p16基因的发现 p16基因又称MTS1基因或CDK4I(cyclin depedent kinase 4 inhibitor)基因或CDKN2基因。

肝X受体α在泡沫细胞胆固醇流出中的调控作用

以THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象 ,观察肝X受体α (LXRα)在THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出中的调控作用 .结果发现 ,2 2 (R ) 羟基胆固醇剂量依赖性增加THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出 ,而DIDS剂量依赖性减少THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出 .逆转录聚合酶链反应显示 ,2 2 (R) 羟基胆固醇可增加THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞LXRαmRNA的表达 ,DIDS可抑制THP 1巨噬细胞源性泡沫细胞LXRαmRNA的表达 .结果提示 ,LXRα在巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出中起着重要的调控作用 。

DADS诱导人结肠癌细胞双向电泳图谱的差异分析

目的近年来,蛋白质组学技术已广泛应用于肿瘤研究领域,但对结肠癌的研究较少。该实验旨在研究二烯丙基二硫(DADS)体外诱导人结肠癌SW 480细胞蛋白质组差异表达的相关分子机制。方法采用蛋白质组学相关技术,如二维电泳、图像分析、质谱技术等方法,获得DADS体外培养的人结肠癌SW 480细胞蛋白质组的肽质量指纹图,将所得的数据进行生物信息学处理。结果在相同条件下,对DADS处理前后SW 480细胞两种样品的总蛋白质进行双向电泳,经PDQuest软件分析,结果显示,其中167个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异,与对照组相比,处理组蛋白质表达量下调的有69个,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术(MALD I-TOF-MS)对其中8个表达明显下调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得相应的肽质量指纹图谱(PMF),通过数据库搜索,初步确定这8个蛋白质分别是:细胞角蛋白19(Cytokeratin-19)、肌动蛋白解聚因子(Actin-de-polym erizing factor)、V-1蛋白(V-1 prote in)、果糖二磷酸醛缩酶(Fructose b isphosphate aldolase,FBA)、FK506结合蛋白(FK506-b ind ing prote in,FKBP)、成帽蛋白(Capp ing prote in)、硫氧还蛋白过氧化物酶(Th ioredoxin peroxidase)和敏感性转化蛋白(Transform ation-sensitive prote in)。结论这些差异蛋白质涉及细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡及细胞分裂增殖等众多事件,从而说明,DADS可能具有抑制结肠癌细胞生长,阻滞细胞周期,诱导细胞分化及凋亡的作用。

羟基磷灰石纳米颗粒载体介导hGM-CSF基因转染HepG2细胞及对其生长的影响

目的:研究羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)纳米颗粒载体携带人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte mac-rophage colony stimulating factor,hGM-CSF)基因转染HepG2细胞,以及其对细胞生长的影响,为基因修饰的肝癌肿瘤疫苗的临床研究奠定基础。方法:采用MTT法检测HA纳米颗粒载体对HepG2细胞生长的影响;采用HA纳米颗粒载体转染技术,将携带有hGM-CSF基因的表达质粒导入HepG2细胞中,G418筛选抗性细胞,限制性稀释法挑选单克隆;RT-PCR法鉴定hGM-CSF的整合和表达,ELISA法测定细胞培养液中的hGM-CSF分泌量和持续的时间;FCM法分析hGM-CSF基因对HepG2细胞生长的影响。结果:MTT结果提示HA纳米颗粒混悬液浓度在80μg/mL以下对HepG2细胞生长的影响与对照组比较差异无统计学意义。RT-PCR结果显示hGM-CSF基因在HepG2细胞中已整合并稳定表达。ELISA检测结果显示转入hGM-CSF基因的HepG2细胞能稳定分泌hGM-CSF,其分泌量为(216.22±45.78)ng/106cells每24h。FCM检测结果则显示hGM-CSF基因不促进细胞凋亡,且对细胞的生长周期无明显影响。结论:HA纳米颗粒载体可以安全地将目的基因hGM-CSF导入HepG2细胞中且稳定表达,其对细胞的生长无明显影响,为基因修饰的肝癌疫苗的后继研究提供了实验基础。

鼻咽癌相关新基因NPCEDRG表达对CNE2细胞生长的影响

为研究鼻咽癌相关新基因NPCEDRG的功能,探讨其对鼻咽癌细胞生长特性的影响,利用Tet-on调控系统,建立受强力霉素(deoxycycline,Dox)诱导NPCEDRG基因表达的CNE2细胞系.运用RT-PCR选择背景表达低、诱导活性高的细胞克隆,以不同浓度Dox诱导CNE2/Tet/TRE-NPCEDRG细胞,确定Dox的最佳诱导浓度.借助形态学观察、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成试验和流式细胞仪分析等方法,对Dox诱导NPCEDRG高表达后CNE2细胞的生物学行为进行了检测.结果显示,NPCEDRG高表达后CNE2细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),克隆形成能力显著降低(P<0.01),瘤细胞群体中处于G0/G1期细胞数增加,S期细胞数减少,细胞阻滞于G0/G1期.Tet调控NPCEDRG基因表达CNE2细胞系成功建立,恢复NPCEDRG表达能部分逆转CNE2的恶性表型,证明NPCEDRG是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因.

AKT-p27^(Kip1)-Cyclin E在胃癌组织中的表达及意义

目的:探讨AKT、p27Kip1与CyclinE表达在胃癌发生发展中的意义.方法:收集2008-01/2010-01湘潭市第一人民医院和南华大学附属南华医院的活检标本和胃癌手术切除标本,包括正常胃黏膜组织14例(胃镜活检标本)、非典型增生胃组织10例(胃镜活检标本)、胃癌组织94例、癌旁组织49例,淋巴结转移胃癌组织35例,制作成组织芯片,每个蜡块设计5×10点阵,阵列的最后一排的最后一孔为空白标记,确定方位顺序.采用免疫组织化学染色,检测胃组织芯片中AKT蛋白、p27Kip1蛋白磷酸化及CyclinE蛋白表达.方向.结果:与正常胃黏膜、癌旁和非典型增生组织相比,AKT蛋白磷酸化和CyclinE蛋白在原发癌、淋巴结转移癌中表达升高(AKT:85.1%,85.7%vs14.3%,26.5%,30.0%;CyclinE:85.1%,82.9%vs14.3%,34.7%,20.0%,均P<0.01),而p27Kip1蛋白磷酸化水平降低(22.3%,17.1%vs71.4%,44.9%,40.0%,P<0.01);与正常胃黏膜组织比较,AKT蛋白磷酸化在非典型增生组织中表达上调(P=0.26).结论:AKT、p27Kip1蛋白磷酸化及CyclinE蛋白表达与胃癌的发生发展有关,随着AKT蛋白磷酸化及CyclinE蛋白表达水平的升高,p27Kip1蛋白磷酸化水平降低.

一个鼻咽癌相关EST的鉴定及其全长cDNA序列分析

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一.通过对鼻咽癌染色体高频率杂合性丢失区域3p21的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)进行同源性比较分析,运用逆转录聚合酶链式反应的方法,筛选到一个在41.18%(14/34)的鼻咽癌活检组织及20.0%(1/5)的鼻咽癌细胞系中表达下调的ESTBG772301;并用Northern杂交方法,检测了该EST在多种正常成人组织中的表达状况及其所代表基因的转录本大小.在此基础上,对该EST来源的cDNA克隆(IMAGE:4839190)进行直接测序,获得了一个全长为2377bp的新cDNA序列;经生物信息学分析,发现它与已知基因序列无明显同源性,属于一个新基因,定位于染色体3p21.3,被命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG,GenBank登录号:AF538150).其编码的蛋白质含169个氨基酸,与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nicolin1(简称NICN1)N端170个氨基酸残基的序列同源性为97%,但缺少NICN1蛋白C端43个氨基酸残基,可能是nicolin1基因不同剪接本的编码产物.

糖尿病小型猪三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达的变化

用贵州小香猪建立 2型糖尿病动物模型 ,探讨糖尿病小型猪三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达的变化 .采用高脂高蔗糖饲料喂养贵州小香猪 ,建立 2型糖尿病动物模型 .血浆总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖的浓度均用氧化酶法测定 ,血浆游离脂肪酸 (FFA)用比色法测定 ,采用逆转录 聚合酶链反应、蛋白质印迹和免疫组织化学分别检测ABCA1mRNA和蛋白质的表达 .喂养 6个月后 ,实验组与正常对照组比较 ,空腹血糖值明显升高 ;空腹胰岛素水平在头 3个月轻度升高 ,在第 6个月末其水平降低 ;血清总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平升高 ;肝组织、冠状动脉、肾组织ABCA1表达上调 ,同时观测到糖尿病小型猪肝组织LXRα表达上调 .结果提示高脂高蔗糖饲料可引起小型猪脂质和糖代谢紊乱 ,并导致肝组织、冠状动脉和肾组织ABCA1表达上调以及肝组织LXRα表达上调 .

Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的建立及其功能初步研究

利用Tet-on调控系统,建立受强力霉素诱导STGC3基因表达的CNE2细胞系,为进一步研究STGC3的功能提供了一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-STGC3转染入CNE2细胞,并用G418和潮霉素分别进行两轮筛选,运用RT-PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度强力霉素诱导CNE2/Tet/pTRE-STGC3细胞,RT-PCR检测STGC3的表达,确定强力霉素的最佳诱导浓度.采用此浓度的强力霉素分别诱导CNE2、CNE2/Tet/pTRE、CNE2/Tet/pTRE-STGC3三组细胞,测定细胞的生长曲线、克隆形成率和细胞周期分布.诱导STGC3基因高表达,CNE2细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),克隆形成能力显著降低(P<0.01);流式细胞仪检测结果显示,瘤细胞群体中处于G0/G1期细胞数增加,细胞阻滞于G0/G1期.Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的成功建立,为进一步研究STGC3基因的功能提供一个理想的细胞模型.

STGC3基因缺失突变对CNE2细胞生长增殖能力的影响

为探讨鼻咽癌候选抑癌基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)对CNE2生长增殖能力的影响,应用基因定点突变技术将该结构域缺失,亚克隆至真核表达载体上,并将野生型及突变型STGC3稳定转染人鼻咽癌细胞系CNE2,检测其对CNE2细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、细胞集落形成能力和细胞周期分布.研究发现,LGdomain的缺失明显降低了STGC3的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性度显著增强,提示该结构域在STGC3发挥肿瘤抑制功能中起着重要作用.

雌激素对转STGC3基因CNE2细胞系生长增殖的影响

为探讨雌激素对STGC3基因抑瘤的促进作用,将重组的pcDNA3.1(+)-STGC3真核表达载体导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选,RT-PCR及蛋白质印迹检测STGC3的表达,获得稳定高表达STGC3基因的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系.采用细胞计数法,检测雌二醇(β-estradiol)对体外培养pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞生长增殖的影响.将pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞接种于裸小鼠前肢背部皮下,观察分析雌性与雄性裸鼠成瘤的差别.运用RT-PCR、免疫组织化学及蛋白质印迹方法,分别从mRNA及蛋白质水平,分析STGC3基因在裸鼠移植瘤组织中的表达状况.移植瘤组织病理切片检查,观察瘤细胞形态学变化.用流式细胞仪测定移植瘤组织的细胞周期分布.研究结果表明:细胞体外培养,pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞经β-estradiol处理后,其生长速度明显减缓(P<0.05);裸鼠体内研究,接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞实验组的移植瘤体积和重量均小于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);实验组中,雌性裸鼠组移植瘤体积和重量均小于雄性组,差异有显著性意义(P<0.05),雌性裸鼠组移植瘤生长最慢,而对照组中雄性与雌性裸鼠组间瘤块的差异无显著性意义(P>0.05);接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的雌性裸鼠组移植瘤,阻滞于G0/G1期细胞数大于其他各组(P<0.05).上述体内外研究结果显示,雌激素可能具有增强STGC3基因对CNE2细胞系的生长抑制作用.