一种体内检测ROP蛋白活性的方法及应用

【目的】建立一种体内检测ROP蛋白活性的方法,为进一步研究ROP蛋白的功能提供技术支持。【方法】该方法基于RIC作为ROP蛋白的效应子能特异地与活性形式的ROP结合这一特点,通过荧火素酶互补试验,借助烟草瞬时表达系统,利用植物活体成像仪和酶标仪进行定性或定量检测荧光强度,从而实现体内检测ROP蛋白的活性。【结果】以拟南芥AtRIC1为检测基因,以AtROP1为例来检测其蛋白活性,成功检测到了AtROP1与AtRIC1有荧光,表明它们有互作。同时对AtROP1蛋白进行了点突变试验,成功构建了持续激活态的ROP1(AtROP1-CA)和持续失活态的ROP1(AtROP1-DN)载体,通过定性定量检测,发现与AtROP1-DN相比,AtRIC1与AtROP1-CA有更强的荧光信号,表明AtRIC1可以作为检测蛋白来检测AtROP1蛋白的活性。此外,通过引入3个蛋白(以AtGAP1、AtGDI1和AtGEF1蛋白为例),利用该方法进一步检测,表明AtGAP1和AtGDI1作为AtROP1蛋白活性的抑制因子,明显降低了AtROP1蛋白的活性;而AtGEF1作为AtROP1蛋白活性的促进因子,明显提高了AtROP1蛋白的活性,说明该方法还可以通过At-RIC1检测其他蛋白对AtROP1蛋白活性的影响。同时,该方法还解决了之前单一的pull-down试验检测ROP蛋白活性变化的问题,增加了一种新的体内检测ROP蛋白活性的方法。【结论】与其他方法相比,该方法具有高灵敏度、可视化、可定量化和操作简单等特点,并且适用于检测其他蛋白对ROP蛋白活性的影响,所以该方法是一种可靠的体内检测ROP蛋白活性的新方法。