葛根素抑制自噬改善脂多糖诱导的小鼠肝脏损伤作用研究

目的观察葛根素对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠肝脏损伤表型的改善作用,并探讨相关分子机制。方法选取18只C57BL/6J小鼠,随机分为3组:0.9%:NaCl(腹腔注射,20 mg·kg^(-1))处理为对照组(6只)、LPS(腹腔注射,20 mg·kg^(-1))为脓毒血症肝损伤模型组(6只)、及模型基础上予以葛根素(腹腔注射,160 mg·kg^(-1))的干预组(6只)。24 h后,检测小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平,HE染色、免疫组化、免疫荧光检测实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测肝脏组织相关基因表达,并用人正常肝细胞株LO2验证。结果与正常对照组比,模型组小鼠的血清ALT和AST水平显著增高,肝脏组织中凋亡相关基因P53和分解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase3,cl.Cas3)表达增多,促炎因子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)水平增加,抗炎因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)水平降低。p62表达减少,Beclin1、LC3B表达增多。给予模型小鼠葛根素干预后,可有效逆转上述指标变化。体外实验重现上述结果。结论在LPS诱导的肝损模型中,葛根素可通过抑制自噬相关蛋白的过度表达,减少肝细胞死亡,改善小鼠的肝脏损伤病理表型,其机制可能是通过下调Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)实现的。提示葛根素早期干预可作为一种治疗肝脏损伤的新方法。

KCNE1胞外N段功能的研究

目的:研究电压依赖性钾离子通道-IKs通道的调节亚基KCNE1胞外肽段(氨基端肽段,简称N段)的功能,探究胞外N段在KCNE1调控IKs通道中的作用。方法:通过分子生物学技术制备KCNE1的N段缺失突变体;利用Western Blot方法了解突变体的蛋白表达情况;以细胞免疫染色方法观察突变体的亚细胞定位情况;以全细胞膜片钳记录技术检测突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征。结果:成功构建KCNE1胞外N段缺失的突变体KCNE1-ΔN,突变体体外表达正常;与野生型相比:KCNE1-ΔN在细胞内的分布出现蛋白集聚现象;通道的电流密度减小,激活电压相比较出现了明显的左移,即通道的激活速率变快。结论:KCNE1的N段对其蛋白表达无明显影响,但对蛋白的转运起重要作用;N段参与了KCNE1对通道电流大小的调节,以及对通道激活特征的调控。

烟曲霉的细胞外囊泡蛋白质及RNA分析

目的分析烟曲霉的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)中的重要成分,以进一步明确曲霉致病机制。方法通过离心法分离烟曲霉的囊泡,用电镜观察形态。采用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪分析溶液中EVs的大小分布。通过质谱仪对囊泡内处理后的肽段进行分析。二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。检测RNA分布,通过数据库分析烟曲霉EVs中miRNA可能参与的一些通路。结果电镜下烟曲霉的EVs可见明显的双层脂质结构。NTA发现烟曲霉分析的EVs大小主要集中在130 nm左右。EVs蛋白中不稳定蛋白为9种(15%),其余为稳定蛋白,而等电点(isoelectric point,PI)>7的为6种蛋白。EVs中大部分是胞浆蛋白,其余比较多的是细胞外分泌蛋白,但仍有25%的蛋白不能定位。通过跨膜蛋白预测(transmembrane prediction,TMPred)和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)预测,有5种蛋白存在于双层脂质膜上的蛋白。检测到RNA中rRNA和tRNA分别占59.7%和29.4%,而miRNA占0.25%,发现EVs-miRNA主要可能影响代谢通路。结论我们证实了烟曲霉也能分泌EVs,其中位直径为130 nm,含有较多种蛋白,以烟曲霉胞浆蛋白为主,RNA以rRNA和tRNA为主,而其中miRNA可能涉及多种信号通路。

miR-22-3p对人肺微血管内皮细胞HMGB1/NLRP3信号通路的调控作用

目的 探究微RNA-22-3p(microRNA-22-3p,miR-22-3p)调控HMGB1/NLRP3通路对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMEC)炎症反应的影响。方法 取腹腔感染导致的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者和健康对照者外周血行miRNA芯片分析,选定目标miRNA,在HPMEC中分别利用目标miRNA类似物和抑制剂进行预先处理,再利用LPS刺激,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCT)和蛋白印迹法检测高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)和Nod样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3,NLRP3)mRNA和蛋白的表达变化,采用RT-qPCT和酶联免疫吸附试验检测细胞和上清中的相关炎症因子水平。结果 miRNA芯片分析显示,miR-22-3p在ARDS患者的血浆中表达显著下调。与阴性对照组相比,转染miR-22-3p类似物后,HMGB1、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平明显降低,活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)水平显著减少。相应的,炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、IL-1β的mRNA水平,细胞上清中炎症因子水平均显著降低(均P<0.05);转染miR-22-3p抑制剂后,HMGB1、NLRP3、Caspase-1蛋白和炎症因子的表达水平显著上调(均P<0.05)。结论 miR-22-3p在腹腔感染导致的ARDS患者外周血中显著下调,可在HPMEC中抑制HMGB1/NLRP3信号通路,并抑制其下游炎症反应。

中老年高血压并非重型新型冠状病毒肺炎患者的临床特征及其病程影响因素分析

目的 探讨中老年高血压并非重型新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者的临床特征。方法 回顾性选取2021-07-22至2021-09-03南京市公共卫生中心收治的中老年非重型COVID-19患者97例。根据入院诊断将患者分为高血压组(46例)与非高血压组(51例)。通过电子病历系统收集患者一般资料、临床表现及发病6、12、18、24 d心肌指标。采用一元线性回归分析和多元线性回归分析探讨中老年非重型COVID-19患者病程的影响因素。结果高血压组患者病程长于非高血压组(P<0.05)。两组临床表现比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组别与时间在心肌肌钙蛋白I(cTnI)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)上不存在交互作用(P>0.05),组别与时间在乳酸脱氢酶(LDH)上存在交互作用(P<0.05);组别在cTnI、α-HBDH、LDH上主效应显著(P<0.05);时间在cTnI、α-HBDH、LDH上主效应显著(P<0.05)。高血压组患者发病6、12、18、24 d cTnI高于非高血压组,发病12、18 dα-HBDH高于非高血压组,发病12 d LDH高于非高血压组(P<0.05)。非高血压组患者发病24 d cTnI、α-HBDH、LDH低于发病6、12 d,发病18 dα-HBDH低于发病12 d(P<0.05);高血压组患者发病24 d LDH低于发病6 d,发病12 dα-HBDH、LDH高于发病6、18、24 d,发病24 d cTnI低于发病12 d,发病24 dα-HBDH、LDH低于发病18 d(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示,高血压、BMI、临床分型、肺部影像学改变是中老年非重型COVID-19患者病程的影响因素(P<0.05)。结论 中老年高血压并非重型COVID-19患者病程较未合并高血压的COVID-19患者长,且心肌损伤更严重;合并高血压、BMI升高、临床分型为普通型、发生肺部影像学改变是中老年非重型COVID-19患者病程延长的危险因素。