脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书。外周血9份,取自正常自愿者。本实验经医学伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞。脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验。正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3d后收集细胞用于实验。③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子。取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况。将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用。结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%。正常人外周血单个核细胞中的CD3+T细胞为60%～70%,CD20+B细胞为3.5%～4.5%。脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞。②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%。后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均<0.05)。结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关。低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞。

脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的作用

目的:骨髓间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应及丝裂原刺激的T细胞增殖,是通过自分泌转化生长因子发挥其免疫调节作用,而关于脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖作用的影响及其机制尚不清楚。实验拟观察验证脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的影响。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所、江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:健康产妇分娩后的脐带血及正常志愿者外周血各9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准。②实验方法:采脐血进行间充质干细胞的培养扩增,并经形态学、细胞表面分子测定及定向分化功能加以鉴定。将1.0×105,0.75×105,0.5×105,0.25×105,0.1×105,0.05×105,0.02×105,0.01×105的间充质干细胞加入到经植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,应用MTT法测定细胞增殖率,观察脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。应用ELISA法测定脐血间充质干细胞培养上清液中转化生长因子β1水平。结果:①不同数量脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖均有抑制作用,抑制作用在一定范围内呈细胞剂量依赖性,以淋巴细胞:间充质干细胞为1:0.75时抑制作用最强。②转化生长因子β1水平与脐血间充质干细胞数量有关,随着间充质干细胞数量增多,转化生长因子β1水平渐增高。③将脐带血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率与转化生长因子β1水平进行相关性分析,两者间存在明显相关性(r=0.85)。结论:①脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖有抑制作用,在一定范围内呈细胞剂量依赖性。②脐血间充质干细胞所分泌的转化生长因子β1含量与脐带血间充质干细胞数量呈正相关性。

线粒体对iPSC再程序化的影响

iPS技术的出现为研究疾病的发病机制、药物筛选以及再生医学提供了新的途径。尽管iPS技术取得了迅速的发展,但对于iPS重编程过程目前仍不清楚。线粒体是细胞的多种生理过程的重要参与者,而其与iPS再程序化过程有什么联系,起到什么样的作用仍有待研究。

骨髓与脐带血间充质干细胞的生物学特性比较

目的:为寻找最佳的间充质干细胞来源,比较脐带血来源间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞在生长、细胞表型及多项分化功能方面的差别。方法:实验于2006-06/2007-03在南昌大学医学院第二附属医院分子实验室、江西省医学分子重点实验室,省级重点实验室完成。①实验材料:脐带血30份及正常骨髓30份均取自正常自愿捐献者,实验经医院伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血及骨髓,分离单个核细胞。将脐血及骨髓单个核细胞以1×109L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数0.20自体血清、1mmol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每三四天换液1次,待细胞90%融合后,经胰蛋白酶+乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞,采用流式细胞术鉴定脐带血来源间充质干细胞表面分子,并比较两种不同来源间充质干细胞的生长特点及向脂肪细胞分化能力的差别。结果:①骨髓来源间充质干细胞在较早阶段形态即成长梭形,第3代后与脐带血来源间充质干细胞形态无明显差别。②培养至第3代的间充质干细胞表面分子检测与脐血单个核细胞比较结果显示,CD166、CD29、CD54表达增高,CD13、CD34、CD45表达降低。③脐带血来源间充质干细胞培养的成功率低于骨髓来源间充质干细胞,在较早阶段脐带血来源间充质干细胞增殖快于骨髓来源间充质干细胞,但后期培养过程中脐带血来源间充质干细胞增殖慢于骨髓来源间充质干细胞,两种来源间充质干细胞均能分化为脂肪细胞,且分化能力无明显差别。结论:脐血来源间充质干细胞作为一种新来源的间充质干细胞在生长速度、培养成功率上虽然低于骨髓来源间充质干细胞,但在细胞表型及分化功能方面无明显差别。

多发性骨髓瘤患者血浆HSP90的表达及其临床意义

本研究检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血HSP90的表达情况,探讨其在MM发病中的作用及与疾病治疗、预后转归的关系。收集58例MM患者和20例健康志愿者的外周血,应用双抗体夹心ELISA法检测血浆HSP90的表达水平。结果表明,MM患者外周血HSP90的表达水平明显高于对照组[(325.205±75.942)vs(85.401±11.261)ng/ml](P<0.001)。HSP90表达水平与MM患者的性别、年龄和疾病分型无关(P>0.05),而与疾病国际分期系统(ISS)的分期、疗效、浆细胞百分比和球蛋白、免疫球蛋白、M蛋白、β2-微球蛋白和轻链水平明显相关(P<0.05)。结论:HSP90在MM患者外周血中的过度表达可能参与了MM发病和进展,检测外周血HSP90的表达水平可能对判断MM患者的病情、疗效和预后有一定临床指导意义。

反义miR-224对人胰腺癌细胞系Aspc-1和Bxpc-3侵袭、迁移的影响及机制研究

目的分析miR-224对胰腺癌细胞侵袭和迁移的影响并探讨其分子机制。方法用miR-224反义寡核苷酸(ASO)降低胰腺癌细胞中miR-224的表达,通过Transwell实验和划痕实验观察miR-224 ASO对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响,用western blot法检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9表达水平的变化。结果与空白对照组和转染无义ASO组相比,miR-224 ASO组miR-224的表达降低(P均<0.05);Transwell实验和划痕实验结果显示miR-224 ASO组胰腺癌细胞的侵袭、迁移能力下降(P均<0.05),MMP-2和MMP-9表达水平下降(P均<0.05)。结论降低miR-224的表达可有效抑制胰腺癌细胞的侵袭和迁移;miR-224有可能成为胰腺癌侵袭转移调控的新靶点。

异氟醚对过氧化氢诱导内皮细胞凋亡的保护作用

目的:探讨异氟醚对体外过氧化氢刺激诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制。方法:体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,分为正常对照组(A组)、异氟醚组(B组)、异氟醚+H2O2组(C组)和H2O2损伤组(D组)。用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测HSP27蛋白表达情况,RT-PCR检测不同组内皮细胞HSP27、Bcl-2和Caspase-3基因的表达。结果:与A组相比,过氧化氢能造成内皮细胞的凋亡(P<0.05),异氟醚可降低过氧化氢引起的人内皮细胞凋亡,表现为细胞凋亡率下降(P<0.05),HSP27蛋白的表达上升,Caspase-3的表达减弱,Bcl-2的表达增强。结论:异氟醚可抑制过氧化氢刺激引起的人内皮细胞凋亡,其作用机制可能与上调HSP27蛋白、稳定细胞内氧化还原水平、促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达及抑制Caspase-3的表达有关。

脐血源性和脐带源性的间充质干细胞生物学特性的比较

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）为中胚层发育的早期细胞，支持造血功能，在一定条件控制下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肝和内皮等多种细胞^[1-7]。因此，作为组织工程种子细胞具有广阔的临床前景。MSC存在于身体的很多部位，目前研究较多的是骨髓和脐血。骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能，

胰腺癌MiR-224的表达与细胞增殖和凋亡

目的:分析miR-224在胰腺癌组织中的表达,探讨其在胰腺癌细胞增殖、细胞周期及凋亡中的意义.方法:采用TagMan MGB探针法定量分析40例原发性胰腺癌及对应的癌旁组织MiR-224的表达;利用反义技术降低胰腺癌细胞(Aspc-1和Bxpc-3)中miR-224的表达;采用MTT比色法检测细胞增殖的改变,利用流式细胞技术检测胰腺癌细胞周期和凋亡情况.结果:在40例胰腺癌病例中,43%(17/40)的胰腺癌组织miR-224表达明显高于癌旁组织(P<0.05);反义miR-224转染胰腺癌细胞Aspc-1和Bxpc-3后,miR-224的表达明显降低,Aspc-1和Bxpc-3胰腺癌细胞生长受到明显抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞的比例下降;另外降低miR-224的表达,Aspc-1和Bxpc-3胰腺癌细胞早期凋亡明显增加.结论:miR-224在胰腺癌组织中表达上调,降低其表达能明显抑制Aspc-1和Bxpc-3细胞的生长和诱导细胞早期凋亡增加,miR-224有可能成为胰腺癌基因表达调控的新靶点.

造血干细胞移植供受者HLA基因配型结果分析

目的分析HLA基因配型结果与患者成活率的关系。方法采用准确、简便的DNA提取方法和PCR-SSP基因分型方法。结果对179例临床标本进行基因水平的研究发现,HLAPCR-SSP基因分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性。配型后的15例造血干细胞移植病人,全部移植成活,现无病存活12人。结论HLA基因分型方法准确、特异、重复性好。经HLA基因配型后患者造血干细胞移植成活率高。

人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

目的拟建立人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系。方法将干细胞分别置于Knockout培养基(第1组)、自制无血清培养基(第2组)和添加bFGF及肝素的改良无血清培养基(第3组)中培养25代后观察比较3组干细胞形态学变化、克隆数目及大小。并借助细胞免疫组化、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测干细胞的未分化状态和全能性。结果传代25次后,第2组克隆逐渐分化。第1组和第3组的干细胞均呈典型的人胚胎干细胞形态特征;细胞表达Nanog,Oct-4,Tra-1-60,SSEA-4,但不表达SSEA-1;流式检测也显示SSEA-4高表达,SSEA-1低表达;体外分化能形成拟胚体。通过单位视野下克隆个数及大小的比较,结果显示第2组与第1组和第3组间的差异显著。结论本研究通过改良本实验室已获得国家专利的无血清培养基,初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系,培养效果与公认培养体系无明显差异。

流式细胞仪检测CD55和CD59表型对贫血性疾病诊断的意义

目的探讨流式细胞仪检测CD55和CD59表型对贫血性疾病诊断的意义。方法采用荧光素标记的CD55和CD59单克隆抗体,流式细胞仪检测30例正常体检者、169例贫血患者(29例阵发性睡眠性血红蛋白尿症、47例再生障碍性贫血、13例缺铁性贫血、12例免疫相关性血细胞减少和18例自身免疫性溶血性贫血、13例骨髓增生异常综合征、11例继发性血细胞减少、12例增生性贫血和14例巨幼细胞性贫血)外周血中CD55和CD59阴性红细胞和CD59阴性中性粒细胞的标记率。结果阵发性睡眠性血红蛋白尿症组CD55阴性红细胞标记率与正常对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05),再生障碍性贫血组、缺铁性贫血组、免疫相关性血细胞减少组、自身免疫性溶血性贫血组、骨髓增生异常综合征组、继发性血细胞减少组、增生性贫血组、巨幼细胞性贫血组CD55阴性红细胞标记率与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05);阵发性睡眠性血红蛋白尿症组、再生障碍性贫血组、缺铁性贫血组CD59阴性红细胞标记率与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),阵发性睡眠性血红蛋白尿症组、再生障碍性贫血组、缺铁性贫血组CD59阴性中性粒细胞标记率与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论采用流式细胞术同时检测外周血中红细胞和中性粒细胞的CD55和CD59补体调节蛋白是目前诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症的最可靠、最敏感的方法,也可作为判断疗效的手段。同时也是临床鉴别诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血和缺铁性贫血的较好方法。

CD4^+CD25^+Foxp3^+/CD4^+CD25^+检测在急性髓系白血病中的应用

目的探讨CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+检测与急性髓系白血病的发病机制、治疗效果及预后的关系,并与CD4+CD25+/CD4+法比较两种检测方法是否存在差异。方法应用流式细胞术法分别检测41例初治AML患者(初治组)、11例一次化疗缓解的患者(化疗敏感组)、9例两次以上化疗不缓解的患者(化疗耐药组)、13例化疗缓解后一直没有复发的患者(持续缓解组)、8例化疗缓解后又再次复发的患者(复发组)和20例健康体检者(对照组)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+在外周血中的比例。结果与对照组相比较,AML患者初治组两类细胞比例均较正常人明显升高(P<0.01),初治患者组两种检测方法间存在显著差异(P<0.01)。与化疗缓解组比较,化疗耐药组两种检测方法检测的比例均明显升高(P<0.01),耐药患者组两种方法间存在显著差异(P<0.01)。与持续缓解组比较,复发组患者的比例明显升高(P<0.01),复发组两种方法间存在显著差异(P<0.01)。结论急性髓系白血病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+与急性髓系白血病的发生相关,并且检测其比例能预测白血病患者对化疗药物的反应及预后,且其灵敏度高于CD4+CD25+/CD4+检测法,而其特异性与CD4+Foxp3+/CD4+检测法一致。

脐带间充质干细胞对兔眼碱烧伤的治疗研究

目的探讨脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的甲基纤维素涂剂对兔角膜损伤的修复作用。方法体外进行UC-MSCs的培养和鉴定,采用NaOH溶液制作兔角膜烧伤模型,烧伤后以甲基纤维素为载体将UC-MSCs移植到烧伤的兔角膜表面,以单纯甲基纤维素组及碱烧伤组作为对照组,在裂隙灯下观察角膜的临床改变。结果成功地培养出UC-MSCs;碱烧伤阳性对照组和单纯甲基纤维素组均可见角膜浑浊呈瓷白色、表面粗糙,不能透见眼内结构。UC-MSCs甲基纤维素组,新生血管较少,角膜表面较光滑,角膜透明度明显改善。结论 UC-MSCs可以在兔角膜表面成活并向角膜上皮细胞分化,UC-MSCs的甲基纤维素凃剂对碱烧伤的角膜损伤有一定的修复作用。

PTEN对子宫内膜癌细胞株迁移和侵袭能力的影响

背景与目的:10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)是较为常见的抑癌基因之一。多项研究表明,其在子宫内膜组织中表达量降低,但是对子宫内膜细胞具体的功能及机制却不十分清楚。本研究旨在探讨PTEN对子宫内膜癌HEC-1B细胞迁移及侵袭能力的影响及相关机制,为子宫内膜癌治疗提供新靶点。方法:运用基因重组技术构建pIRES2-ZsGreen1-PTEN重组质粒;将重组质粒转染至子宫内膜癌HEC-1B细胞中,以转染pIRES2-ZsGreen1空载质粒为对照;运用体外划痕、Transwell迁移及侵袭实验分别检测过表达PTEN后细胞迁移和侵袭能力的变化;运用Western blot法检测过表达PTEN后细胞中PTEN、AKT、p-AKT及MMP-2蛋白表达量的变化。结果:PCR产物凝胶电泳显示一条1.2 kb大小的条带,与PTEN cDNA大小符合;基因测序结果与Genbank中PTEN cDNA的序列一致,表明质粒构建成功;转染后48 h荧光显微镜下见荧光且Western blot显示PTEN蛋白表达量增加,表明重组质粒在HEC-1B细胞中表达成功;体外划痕及transwell迁移实验表明,过表达PTEN后HEC-1B细胞的迁移能力减弱;体外侵袭实验显示,过表达PTEN后HEC-1B细胞的侵袭能力明显低于对照组及未处理组;Western blot结果表明,过表达PTEN会降低HEC-1B细胞中p-AKT蛋白表达下降,但是AKT蛋白量却不受影响,同时p-AKT下游的MMP-2蛋白表达量下降。结论:PTEN能明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的迁移和侵袭,这一作用可能是通过抑制AKT磷酸化,从而降低MMP-2蛋白的表达而实现的。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子RNAi慢病毒载体的构建

目的构建人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法参照文献设计RNAi靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生RNAi慢病毒载体pGC-LV。PCR鉴定阳性克隆并测序,将测序正确的pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒经脂质体2000共转染293T细胞,获得重组慢病毒,用逐孔稀释法测定病毒滴度。结果合成的含EMMPRIN vshRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;病毒包装后滴度为1×109 TU/ml。结论应用基因工程技术成功构建了可供感染的EMMPRIN基因RNAi慢病毒载体,此为进一步研究EMMPRIN在急性白血病中的作用奠定了实验基础。

细胞实验室污染原因及有效预防控制措施的分析

目的针对细胞实验室出现严重污染情况,进行污染原因调查分析,并探索预防污染措施。方法干预前后3次采集无菌培养室不同方位的空气,培养箱各个层面的气体,净化工作台面棉拭子,净化工作台四个顶角及台面中央同时采集了5个空气点,可疑细胞培养基等进行置入血平板培养基和PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基,即Potato Dextrose Agar)后观察是否有微生物生长。结果干预前3次取样24h、48h培养,经VITEK2-Compact全自动微生物分析仪鉴定均为鲍曼不动杆菌和白念珠菌。干预后采用同样的方法取样培养,未见培养基上克隆生长。结论干预措施能够有效的消除细胞实验室出现的严重污染。