艾滋病痴呆综合征患者HIV-1 nef基因多样性分析

目的研究艾滋病痴呆综合征（ADC）患者体内HIV-1nef基因变异规律，为ADC发病机制的研究提供依据。方法提取1例ADC病例尸检标本的外周（脾）和中枢神经系统（基底核、额叶灰质、脑膜、颞叶）共5个部位组织中的基因组DNA，PCR扩增HIV-1nef基因，与pMDl9-T克隆载体连接后，蓝白斑筛选挑取阳性菌落测序，序列经BLAST分析后，每个部位取5个序列，利用Bioedit、MEGA4等生物学软件进行基因距离、系统进化树以及同义／非同义替换值（ds／dn）等分析。结果该ADC患者感染的是HIV-1B亚型，与标准序列HXB2比较，该病例的HIV-1nef基因存在变异，且外周组织与中枢神经系统各组织间以及中枢神经组织不同部位的基因变异不同，相同组织来源的nef序列基因距离较小，外周和中枢的nef基因距离差异较大，该病例HIV-1nef基因在外周和中枢神经系统变异时均受到负向选择压力。结论ADC患者体内HIV-1nef基因存在多样性，且不同组织部位的基因变异不同，其导致的Nef蛋白某些氨基酸位点的改变对其生物学活性的影响有待进-步研究。

艾滋病痴呆综合征患者体内HIV-1 Nef氨基酸位点变异分析

目的研究艾滋病痴呆综合征（ADC）患者体内不同部位HIV-1 nef基因变异导致氨基酸位点的改变，为研究ADC发病机制提供思路。方法克隆1例ADC病例尸检标本的外周（脾）和中枢神经系统（基底核、额叶灰质、脑膜、颞叶）共5个部位HIV-1 nef。基因并测序，利用Bioedit、MEGA4等生物学软件与HIV-1标准株HXB2Nef氨基酸序列进行比对，分析氨基酸位点变异情况。结果该ADC患者Nef蛋白某些氨基酸位点发生改变，且外周组织与中枢神经系统问及中枢神经系统不同部位问的变异情况不同，某些变异为外周和中枢所共有，某些变异仅发生在外周脾，而某些变异仅发生于中枢神经系统。这些变异可能不同程度地改变Nef蛋白某些生物学活性及功能，进而影响到HIV-1病毒的复制、感染及凋亡等。结论ADC患者体内的HIV-1 nef基因变异可导致Nef蛋白某些氨基酸位点改变，且可能对其生物学活性造成影响，这些变异是否与ADC的发病机制有关有待进-步研究。

HAD患者来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞分泌TNF-α和IL-1β细胞因子的影响

目的探讨HIV-1负调控因子(Nef)在HIV-1神经致病性中的作用。方法从HIV-1相关痴呆(HIV-associated dementia,HAD)患者的中枢神经系统(central nervous system,CNS)和外周5个部位(基底结、额叶皮质、脑膜、颞叶皮质和脾)中获得5株不同的HIV-1 nef基因,与载体pcDNA3.1连接构建重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体,转染人神经胶质瘤细胞U87。转染后22 h、27 h、32 h、37 h和42 h经免疫组化法和Western blot检测Nef蛋白表达情况,采用JEDA801D和JD-801软件对结果进行半定量分析。转染后27 h~62 h,每间隔5 h收集U87细胞的培养上清,ELISA测定上清中两种细胞因子TNF-α和IL-1β的含量,分析两种细胞因子的动态表达情况。结果成功构建5株来自一例HAD患者不同部位组织的nef基因的重组的pcDNA3.1-nef真核表达载体,转染U87细胞。免疫组化实验的结果显示,Nef蛋白在转染后42 h开始表达,Western blot进一步证实了这一结果。ELISA结果显示,转染后22 h、27 h、32 h、37 h,各组上清中细胞因子的含量随时间逐渐增多,但各组间的差异均无统计学意义(TNF-α:F=0.445,P=0.837;F=0.579,P=0.742;F=0.617,P=0.714;F=2.728,P=0.057。IL-1β:F=2.656,P=0.062;F=0.485,P=0.809;F=0.165,P=0.982;F=2.463,P=0.093);42 h后,各组细胞因子含量逐渐降低,57 h~62 h,TNF-α及IL-1β含量基本维持稳定;转染后42 h、47 h、52 h、57 h、62 h,实验组两种细胞因子的含量明显高于对照组,差异有统计学意义(TNF-α:F=241.310,P<0.001;F=242.638,P<0.001;F=250.114,P<0.001;F=143.877,P<0.001;F=146.172,P<0.001。IL-1β:F=251.578,P<0.001;F=188.816,P<0.001;F=276.240,P<0.001;F=238.136,P<0.001;F=163.361,P<0.001),各对照组间或实验组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论HIV-1 Nef蛋白能诱导并增强U87细胞分泌TNF-α和IL-1β的能力,而HAD患者体内不同来源的HIV-1 Nef蛋白发生氨基酸变异对U87细胞分泌TNF-α和IL-1β无影响。