HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。

HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

目的优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A0203-BSP),并制备负载HLA-A0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体(HLA-A0203/SVR)。方法以HLA-A0203-BSP原核表达载体转化E.coliBL21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果当IPTG的浓度为0.4mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%。负载抗原肽的可溶性HLA-A0203/SVR单体是在同时存在HLA-A0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性。结论HLA-A0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A0203/SVR四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。

可溶性HLA-A~*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA—A＊0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽（BSP）的融合蛋白CHLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA—A28供者外周血单个核细胞（PBMC）中克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，并测序鉴定，然后以PCR方法构建HLA-A＊0203一BSP的原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示，从3名HLA-A2＊供者PBMC中克隆的cDNA中，只有从供者2获得编码HLA-A＊0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21（ED3）中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％；产物相对分子质量约为34kDa，与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A＊0203重链基因的cDNA，构建HLA-A＊0203-BSP融合蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达，为制备HLA-A＊0203四聚体打下基础。

可溶性人sPD-L1及其抗体的制备和鉴定

通过固定化金属离子亲和层析进行柱上复性与纯化,获得高纯度的可溶性PD-L1胞外域(sPD-L1),其纯度达95%,纯化的sPD-L1经免疫印迹分析得到验证,并具有与其受体PD-1的特异性结合活性;以该抗原免疫小鼠获得高滴度的抗血清,并以制备的sPD-L1-HiTrap亲和层析柱纯化获得高纯度特异性抗体;将该抗体与另一商业化抗体结合建立了一种灵敏的双夹心ELISA法,检测范围为1ng/mL^100ng/mL,可用于分析可溶性PD-L1的含量。可溶性sPD-L1及其抗体的制备不仅可用于人体内特异性抗体和可溶性PD-L1的检测,同时也为进一步研究其体内外活性及其受体的性质提供了条件。

高频等位基因HLA-A* 1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。

健康青年人HCMV特异性CD8^+T细胞频率和表型分析

目的利用负载pp65495-503抗原肽的HLA-A*0201四聚体染色结合流式细胞术,分析HLA-A2+健康青年供者外周血中HCMV pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞的频率和表型。方法以优化的四聚体染色方法对22例中国青年供者全血进行染色,用流式细胞仪对样品进行三色荧光分析。结果健康中国青年人外周血中存在高频率的pp65495-503特异性CD8+T细胞,占CD8+T细胞的百分率为0.14~6.84%(均数2.45%);表型分析显示其CD28+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为为32.5%(±21.7%)和58.58%(±10.4%)(P<0.001);CD57+细胞占四聚体阳性和四聚体阴性细胞的百分率分别为55.8%(±18.4%)和27.4%(±8.3%)(P<0.001)。同时,对三例健康青年人CD8+T细胞上多种表面分子的详细分析显示,pp65495-503特异性记忆CD8+T细胞有不同比率的细胞表达CD62L、CD45RO、CD38和CD27,而且还有一定比例的细胞表达CD45RA,但不表达活化抗原CD69分子。结论青年中国人外周血中存在高频率的HCMV特异性CD8+T细胞,这些细胞的表型存在高度异质性,可能是处于不同分化阶段的记忆和效应细胞群体组成。

负载HCMV pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体的制备和鉴定

为体外复性制备负载人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原肽的HLA-A*1101-GPI四聚体,研究优化HLA-A*1101重链与生物素化酶底物肽融合蛋白(HLA-A*1101-BSP)在大肠杆菌中的诱导表达的温度、时间和诱导剂IPTG浓度,并以抗HLA-A*0201抗血清进行免疫印迹鉴定HLA-A*1101-BSP的表达水平。将初步纯化的HLA-A*1101-BSP与β2-微球蛋白(β2m)和HCMV抗原肽pp6516-24(GPISGHVLK,简称GPI)一起利用稀释法进行重折叠复性,获得可溶性HLA-A*1101-GPI单体,经生物素化和纯化后,与Streptavidin-PE结合成四聚体。流式细胞仪分析显示HLA-A*1101-GPI四聚体具有与特异性细胞毒T细胞(CTL)的结合活性,表明成功获得可溶性HLA-A*1101-GPI四聚体,为研究HLA-A*1101限制性CTL的免疫应答打下基础。