结直肠肿瘤细胞球的干细胞相关特性研究

目的:无血清悬浮培养生成5种人结直肠肿瘤细胞球,体外稳定传代培养,研究其在体外增殖、分化及转移等生物学特性。方法:人结直肠癌细胞SW480、SW620、LOVO、HT29和HCT116在添加了细胞生长因子的无血清培养基(Serum-free medi-um,SFM)中悬浮培养,稳定传代并诱导分化。选择其中HCT116细胞系用流式细胞技术检测单层细胞及其肿瘤细胞球干细胞标记分子CD133+的表达。Transwell小室实验、免疫荧光及RT-PCR分别检测HCT116单层细胞及其肿瘤细胞球的体外转移能力,以及间质化标记分子N-cadherin及Vimentin的表达。结果:5种人结直肠癌细胞系均在SFM中形成能稳定传代培养的肿瘤细胞球,其在含血清培养基(Serum supplemented medium,SSM)中重新贴壁生长并各自恢复亲代细胞的生物学特性。与HCT116单层细胞相比,HCT116肿瘤细胞球中CD133+细胞比例显著增多,并具有更强的转移能力,以及高表达间质化标记分子N-cad-herin及Vimentin。结论:通过无血清培养可以生成人结直肠肿瘤细胞球,这些球体中富含肿瘤干细胞样特性的细胞。

Twist在结直肠癌中的表达及在上皮间质转化中的作用

目的观察结直肠癌中Twist基因的表达以及与结直肠癌恶性生物学行为的相关性。方法采用免疫组化S-P法及逆转录-聚合酶链反应检测10例正常结直肠粘膜、25例结直肠癌癌灶中心及癌灶边缘组织、9例淋巴结转移灶中Twist、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表达水平。结果 Twist的表达与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤原发部位、分化程度无统计学差异(P>0.05),与有无淋巴结转移、Dukes分期、TNM分期有统计学差异(P<0.05)。4种蛋白在以上4种组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05)。Twist、Vimentin、N-cadherin在结直肠癌灶边缘组织和淋巴结转移灶中的表达高于正常结直肠粘膜和癌灶中心中的表达(P<0.05)。E-cadherin在正常结直肠粘膜和癌灶中心中的表达显著高于结直肠癌灶边缘组织和淋巴结转移灶中的表达(P<0.05)。Twist、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin在4种组织中阳性表达率与其相应mRNA的表达水平呈显著正相关(P<0.05)。在结直肠癌及淋巴结转移灶中,E-cadherin表达水平与Twist呈负相关(r=-0.263,P<0.05;r=-0.605,P<0.05),Vimentin的表达水平与Twist呈正相关(r=0.214,P<0.05;r=0.470,P<0.05),N-cadherin的表达水平与Twist呈正相关(r=0.381,P<0.05;r=0.581,P<0.05),而E-cadherin表达水平与Vimentin呈负相关(r=-0.562,P<0.05;r=-0.591,P<0.01),E-cadherin表达水平与N-cadherin呈负相关(r=-0.267,P<0.05;r=-0.617,P<0.01)。结论 Twist可能通过调控上皮间质转化(epithelial-mesenchymail transition,EMT)从而参与了结直肠癌的浸润、转移等过程,所以结直肠癌中Twist的表达及EMT发生可能成为独立于TNM分期以外判断结直肠肿瘤预后及浸润转移的生物学指标。

RAD51和BRCA1在结直肠癌中的表达及临床意义

目的观察结直肠癌中RAD51和BRCA1基因的表达,探讨二者与结直肠癌发生发展及治疗的关系。方法收集结直肠癌癌灶及癌旁正常组织各42例,采用免疫组织化学法及逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测标本组织中RAD51、BRCA1蛋白和mRNA的表达水平。分析RAD51、BRCA1在结直肠癌中的表达水平与临床病理特征的关系以及二者之间的相互关系。结果在结直肠癌组织中RAD51(33例,78.6%)、BRCA1(30例,71.4%)的表达较癌旁正常组织RAD51(7例,16.7%)、BRCA1(18例,42.9%)高(P<0.05);结直肠癌中RAD51mRNA(0.51±0.26)和BRCA1mRNA(0.70±0.96)的值较两者在正常组织中mRNA(0.10±0.22)高(P<0.01);两者蛋白及mRNA的表达水平与性别、年龄、分化程度、TNM分期等均无统计学差异(P>0.05);BRCA1与RAD51在结直肠癌中的表达水平成明显正相关(蛋白:r=0.731,P<0.01mRNA:r=0.572,P<0.01)。结论 BRCA1与RAD51在结直肠癌组织中高表达,且二者的表达水平呈明显正相关;BRCA1与RAD51的表达异常可能与结直肠癌的发生发展有关。

腹腔镜胆囊切除术中损伤性并发症的处理体会

自1988年首例腹腔镜胆囊切除术（Laparoscop—iccholecystectomy，LC）获得成功，腹腔镜技术逐渐应用于胆囊手术，具有疗效确切、安全、创伤小等优点。在胆囊切除术中，由于胆囊三角的解剖变异多样及胆囊的毗连解剖关系较复杂，手术中损伤临近血管及脏器是腹腔镜胆囊切除手术中较为严重的并发症，如果处理不当会给患者带来难以弥补的后果。现总结我院9例腹腔镜胆囊切除手术的临床资料，并将预防和治疗措施报道如下。

腹腔镜阑尾切除术中转开腹及再手术的处理体会

随着腹腔镜手术的逐步开展，腹腔镜阑尾切除术（ laparo-scopic appendectomy，LA）已成为急性阑尾炎的首选术式，LA 具有患者损伤小、并发症少、康复快、美观等开腹手术无法比拟的优点［1］。但由于腹腔镜操作者的技术水平和经验欠缺，及术中阑尾炎症程度和局部解剖的差异，使得 LA 中转开腹乃至手术失败需再次手术时有发生。2012年1月～2015年1月，我院有LA 中转开腹17例及再次手术9例，中转开腹率为0.489％，再手术率为0.259％。现进行回顾性分析，总结经验教训。

腹股沟疝手术部位感染的诊断及处理对策

目的探讨腹股沟疝无张力修补术后手术部位感染的诊断及处理对策。方法回顾性分析都江堰市医疗中心普外二科2006年10月-2013年12月期间收治的32例腹股沟疝无张力修补术后发生手术部位感染患者的临床资料,对患者切口的感染及愈合情况进行总结分析。结果确诊腹股沟疝无张力修补术后手术部位感染32例,浅层感染26例,深层感染6例,感染原因与手术局部的处理、患者全身情况、基础疾病、补片的植入等相关。30例患者经拆线、清创、放置引流、换药后切口达到良好愈合,2例手术去除补片后,未再重新放置补片,二期缝合。术后32例患者成功获访,随访时间为6~24个月（平均20个月）。随访期间,均无切口下积液、切口感染、肠瘘、术后疼痛及复发等并发症出现。结论腹股沟疝无张力修补术后手术部位感染依靠局部体征、B超及CT检查诊断相对简单,浅层感染处理比较容易,而且没有争议,清创和换药引流,大部分效果良好。目前难处理的是深层感染,难点是：（1）何时进行外科介入治疗;（2）以何种方式介入;（3）补片是否要取除。

结肠癌细胞系SW620中ALDH1^(br)细胞特性的研究

目的检测结肠癌细胞系SW620中是否存在肿瘤干细胞样细胞。方法按照ATCC标准培养SW620细胞,用AL-DEFLUOR试剂盒联合荧光激活细胞分类术(FACS)分选ALDH1br细胞,无血清培养2周后再次进行FACS检测,观察ALDH1br细胞自我更新及增殖情况;检测ALDH1br细胞血清诱导1周后分化标志物CK20含量、ALDH1活性及耐药蛋白ABCG2含量的变化;Transwell小室实验检测ALDH1br细胞的迁移能力。结果经FACS检测,SW620中ALDH1br细胞比例为3.59%;无血清培养2周后,ALDH1br细胞增加至43.0%±2.2%,且不对称性分裂为ALDH1br细胞和ALDH1-细胞;经血清诱导1周后,ALDH1br细胞分化标志物CK20含量明显增高(0.64±0.040、.01±0.02,P<0.05),且ALDH1br细胞比例下降(1.73%);分选后ALDH1br细胞的耐药蛋白ABCG2含量也明显增加(0.27±0.03、0.90±0.05,P<0.05);ALDH1br细胞比普通的SW620细胞具有更强的迁移能力(细胞穿孔数分别为58.5±3.6、9.4±2.1,P<0.05)。结论运用ALDEFLUOR试剂联合FACS从结肠癌细胞系SW620中分选出的ALDH1br细胞具有肿瘤干细胞样特征。

经皮微波消融术治疗的肝海绵状血管瘤患者血红蛋白尿发生及其处理

目的探讨经皮微波消融术治疗肝海绵状血管瘤(HCHs)患者的疗效,并探讨术后血红蛋白尿发生及处理方法。方法2012年2月~2017年12月我院诊治的HCHs患者54例,病灶数80个。采用在超声引导下经皮微波消融术治疗。采用联苯胺试验检测血红蛋白尿。术后随访6~12 m。结果在54例HCHs患者的80个病灶中,经皮微波消融术治疗后,78个肿瘤完全被消除,2例被大部分消融;术后6~12个月对患者进行超声造影和CT检查随访,所有患者血管瘤均缩小,其中瘤体完全消失者41例(75.9%),瘤体缩小超50%者8例(14.8%),瘤体缩小大于25%但小于50%,但未见肿瘤复发者4例(7.4%),瘤体缩小小于25%,但是未见肿瘤复发者1例(1.9%);术中未出现严重的肝肾功能损害,术后3~4 h有8例(14.8%)患者出现血红蛋白尿,经水化和碱化尿液处理2 d后,尿色恢复正常;2例(3.7%)出现腹水,经内科综合治疗后消退;5例(9.3%)出现右上腹轻微的疼痛,未经干预自行缓解;7例(12.3%)出现恶心呕吐,经止吐处理后缓解。结论经皮微波消融术是一种疗效确切、创伤小的治疗HCHs患者的方法,选择合适的患者进行治疗,可以达到微创治疗的目的。对少数发生的血红蛋白尿,经对症处理,预后良好,但应总结其发生的原因,予以避免。

区段肝蒂肝切除术与B超引导下肝切除术治疗肝胆管结石患者临床价值分析

目的研究区段肝蒂肝切除术与B超引导下肝切除术治疗肝胆管结石患者的临床价值。方法2014年12月~2017年12月我院收治的80例肝胆管结石患者被随机分为观察组和对照组,每组40例,分别接受区段肝蒂肝切除术和B超引导下肝切除术。术后随访7个月。结果观察组术中出血量为(350.4±105.7)mL,显著少于对照组【(489.6±154.6)mL,P<0.05】,术后肝断面引流量为(280.4±78.2)mL,显著少于对照组【(365.7±116.4)mL,P<0.05】,儿两组手术时间、术中输血量、排气时间和术后住院日比较,差异均无统计学意义(P>0.05);术后2周,观察组血清谷草转氨酶为(54.6±15.2)IU/L,显著低于对照组【(80.6±21.1)IU/L,P<0.05】,谷丙转氨酶为(87.2±28.1)IU/L,显著低于对照组【(121.3±30.8)IU/L,P<0.05】,谷氨酰转肽酶为(197.6±65.3)IU/L,显著低于对照组【(269.9±87.6)IU/L,P<0.05】,碱性磷酸酶为(216.9±77.4)IU/L,显著低于对照组【(312.3±95.6)IU/L,P<0.05】;观察组结石残留率为7.5%,显著低于对照组的40.0%(P<0.05);观察组术后并发症发生率为25.0%,显著低于对照组的55.0%(P<0.05)。结论与B超引导下肝切除术比,采取区段肝蒂肝切除术治疗肝胆管结石患者具有出血量少、术后并发症少的优势,有利于保护肝功能和术后恢复。

人结直肠癌细胞株来源的HCT116肿瘤细胞球的转移相关特性

目的:无血清悬浮培养生成HCT116肿瘤细胞球,检测球中CD133表面标志分子的细胞定位,以及CD133+细胞所占的比例,并探索肿瘤细胞球发生上皮-间质转化与其转移能力之间的可能联系。方法:HCT116细胞在添加了细胞生长因子的无血清培养液(serum-freemedium,SFM)中悬浮培养生成细胞球,应用激光共聚焦和流式细胞仪检测CD133表面标志分子的细胞定位及细胞球中CD133+细胞的含量。Transwell小室实验、免疫荧光及反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)法分别检测细胞球的体外转移能力以及上皮-间质转化关键分子的表达情况。结果:HCT116细胞球中CD133表面标志分子定位于各个球层面的细胞膜,并且CD133+细胞比例显著增多。细胞球高表达间质化分子N-cadherin及Vimentin,而上皮化分子E-cadherin表达水平下降,并具有更强的转移能力。结论:HCT116细胞球中富含CD133+细胞,CD133表面标志分子定位于细胞膜,细胞球可能通过上皮-间质转化而获得更强的转移能力。

人结直肠癌细胞系的成球培养方法及转移侵袭能力研究

目的探索人结直肠癌细胞系形成肿瘤细胞球的培养方法及球体内间质化标志物的表达检测。方法结直肠癌细胞系SW480、SW620、LOVO、HT29及HCT116在添加了不同细胞生长因子的无血清培养基(SFM)中悬浮培养,传代更新,诱导分化。免疫荧光技术和RT-PCR分别检测细胞球中间质化标志物N-cadherin及Vimentin的表达情况。结果 5种细胞系均能在特制的SFM中形成细胞球,并稳定的传代增殖。在用血清谤导分化后,又重新贴壁生长,且与亲代细胞保持一致的细胞形态。细胞球中间质化标志物N-cadherin、Vimentin表述均上调。结论结直肠癌细胞系在低黏附及添加了细胞生长因子R-Spondin 1、Noggin的无血清环境中更容易形成悬浮生长的肿瘤细胞球,细胞球细胞比亲代细胞更具有转移侵袭能力。

实体瘤中SP细胞亚群的肿瘤相关特性研究进展

SP(Side Population)细胞又叫侧群细胞,是一群能将DNA结合染料Hoechst33342等排出胞外,通过流式细胞仪检测呈Hoechst33342低染的细胞。通过对相关研究分析发现实体肿瘤组织中的SP细胞同样可以通过流式细胞仪分离纯化,由于其具有自我更新、分化等特性被认为其中富集了肿瘤干细胞。目前,在各种实体瘤中都验证了SP细胞的存在,由于具有干细胞及外排内外源化学物质的特性,SP细胞可能是肿瘤复发和耐药的根源,对SP细胞的研究将会给肿瘤的根除提供一套新的策略。

无血清分离人结直肠癌细胞的体外培养形态及标志物表达特征

目的探讨人结直肠肿瘤干细胞在体外分化过程中细胞形态和干细胞相关标志物CD133的表达变化,为进一步研究结直肠肿瘤干细胞分化走向提供实验依据。方法取来源于人结直肠癌的细胞系HCT116,无血清培养分离出CD133+细胞,加血清诱导分化,相差显微镜下观察其形态变化;在未分化状态下无血清培养第7天和14天与血清诱导分化后收集细胞,利用流式细胞仪检测干细胞标志物CD133的表达量,采用激光共聚焦检测CD133表面标记分子的表达。结果 1)细胞形态:无血清培养分离的CD133+细胞,在生长过程中聚集成规则的细胞球,血清诱导后即贴壁生长,贴壁形态与同来源细胞形态一致,且再次无血清悬浮培养后聚集成球稳定生长。2)标志物变化:结直肠肿瘤干细胞未分化时CD133表面标记分子高表达,流式细胞仪检测未分化细胞CD133第7天表达率为(20.4±0.52)%,第14天表达率为(78.5±2.80)%,分化后表达率为(0.50±0.17)%。结论细胞形态和标志物表达改变均表明高表达CD133+的HCT116结直肠癌肿瘤干细胞可定向分化为同源的结直肠癌细胞,CD133+细胞经血清诱导后表达下调而使细胞失去干细胞特性。

长程缺氧对结肠癌细胞增殖的影响

目的:体外观察长程缺氧环境对结肠癌细胞SW480和HCT116增殖能力的影响并探讨其可能的作用机制。方法:缺氧培养结肠癌SW480和HCT116细胞14～28d,采用MTT法和平板克隆法检测缺氧条件下2种结肠癌细胞增殖能力的改变;激光共聚焦显微镜下观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin的表达;蛋白质印迹法检测HIF-1α和β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、Ser9被磷酸化的GSK-3β[phospho-glycogen synthase kinase-3β(Ser9),pGSK-3β(Ser9)]以及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。以常氧下培养的这2种细胞作为对照。结果:细胞生长曲线和平板克隆检测结果均显示,长程缺氧适应后SW480和HCT116细胞的增殖能力较常氧下明显增强(P<0.01);激光共聚焦显微镜下观察发现,HCT116细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达部位发生改变;蛋白质印迹法检测发现,与常氧组比较长程缺氧组细胞中HIF-1α(P<0.05)、β-catenin(P<0.05)和pGSK-3β(Ser9)(P<0.01)蛋白的表达均上调,而总GSK-3β的表达无明显变化,PCNA在缺氧条件下表达上调(与常氧组比较,在SW480细胞中P<0.05,在HCT116细胞中P<0.01)。结论:缺氧适应可促进结肠癌细胞SW480和HCT116的增殖,这可能是HIF-1α与Wnt/β-catenin信号转导通路共同作用的结果。