激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

多发性骨髓瘤 (multiplemyeloma ,MM )细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节。Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一 ,它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚。本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用。利用RT PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch 1胞内区 (IntracellulardomainofNotch ,ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株 ,以建立激活Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系 ;采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡。结果表明 :RT PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达Notch 1及相关分子 ,逆转录病毒可以介导外源Notch ICN在骨髓瘤细胞中表达 ,激活Notch信号可以抑制二甲基鞘氨醇 (N ,N dimethylsphingosine,DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论 :Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用 ,这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点。

佝偻病实验动物模型的建立

根据佝偻病的主要发病机理，幼龄大鼠皮下注射HEDP建立了佝偻病模型。结果表明：28日幼龄大鼠，每日皮下注射HEDP（1-Hydroxyethyliden-11-biphosphonate1-羟基亚乙基二磷酸盐）25mg／kg，连续7d后，出现明显的佝偻病症状。主要表现为体重增长减慢，股骨湿重及骨矿物质含量减少，长骨增长缓慢，骨骺板增宽，骺端膨大，胫骨弯曲和纵径缩短，血清碱性磷酸酶的活性增高及24h尿钙排泄量明显减少等，形成典型的佝偻病病理改变。

人Delta-like-1胞外区在CHO细胞的表达纯化及对造血祖细胞的扩增作用

Notch信号通路在调控造血干细胞的增殖分化中具有重要作用。本研究克隆表达人Notch配体Delta like 1(Dll 1)的胞外区 (hDll 1ext) ,并观察其对脐带血造血祖细胞的扩增作用。从人骨髓单个核细胞中提取总RNA ,用RT PCR的方法扩增Delta like 1基因胞外区 ,克隆到T载体。测序正确后 ,亚克隆到pcDNA3.1/Myc His(+)A表达载体。用脂质体转染CHO细胞 ,G4 18筛选单克隆 ,Western印迹检测hDll 1ext的分泌表达情况。选择表达量高的细胞克隆 ,扩增并收集上清。用金属亲和层析柱从上清中纯化融合蛋白hDll 1ext。利用免疫磁性分离方法分离脐带血CD34+ 细胞。结果表明 ,RT PCR方法检测到脐带血CD34+ 细胞表达Notch 1受体。在含rhIL 3,rhSCF及rhVEGF的脐带血CD34+ 细胞无血清培养体系中 ,加入纯化的hDll 1ext,通过集落培养检测hDll 1ext对造血祖细胞的扩增作用。含hDll 1ext组中CFU Mix和HPP CFC数量是对照组的 1.5倍 ,结论 :重组的hDll

肝细胞生长因子对骨髓内皮祖细胞的动员作用

目的 :分析肝细胞生长因子 (HGF)能否动员骨髓内皮祖细胞 ,以及动员的内皮祖细胞能否参与创伤修复时的血管新生和内皮修复。方法 :将腺病毒HGF载体 (adenovirusvectorencodingHGFgene,Ad HGF)经尾静脉注射到Balb/c小鼠体内 ,用ELISA方法检测血浆HGF水平的变化 ;用流式细胞术检测外周血CD34+ 细胞含量变化 ;对外周血单个核细胞进行分离、培养 ,并对生长的细胞克隆进行内皮细胞表面标志Tie 2、vW因子的免疫组化检测。建立雌性小鼠CCl4肝损伤模型 ,静脉移植HGF处理后雄性小鼠外周血单个核细胞到其体内 ,4W后利用原位杂交技术检测新生肝组织中是否存在雄性细胞。结果 :注射Ad HGF能明显提高小鼠血浆的HGF水平 ,并使外周血中以CD34、Tie 2和vW因子等为标志的内皮祖细胞的数量显著增多。这些细胞参与肝损伤修复时的血管新生。结论 :HGF对骨髓内皮祖细胞具有明显的动员作用。

干细胞因子促进造血细胞与纤连蛋白的粘附

造血细胞粘附与细胞外基质在造血细胞的存活、增殖、分化及归巢中起重要作用。本研究以细胞因子依赖细胞系Mo7e细胞为靶细胞 ,观察了干细胞因子 (SCF)对造血细胞粘附于纤连蛋白的促进作用。结果表明 ,Mo7e细胞表达β1,α4和α5整合素及SCF受体c kit,SCF可明显刺激Mo7e细胞粘附于纤连蛋白并具有量效关系 ,PI 3激酶通路抑制剂 ,抗β1,α4和α5整合素抗体可阻断该作用。结论提示 ,SCF对造血细胞粘附于纤连蛋白的促进作用是通过整合素介导的 ,并与PI

多发性骨髓瘤基因修饰瘤苗诱导体内抗肿瘤反应的实验研究(英文)

本研究目的是评价NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型对多发性骨髓瘤基因修饰瘤苗引发体内抗肿瘤反应的效果。首先给NOD/SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞以在其体内重建人的免疫系统,然后皮下接种γ-射线灭活的基因修饰骨髓瘤细胞sko-007(表达绿色荧光蛋白或者p53、GM-CSF和B7-1基因),以PBS作为对照,最后植入活sko-007细胞进行攻击。结果发现,与对照组相比接种感染腺病毒Ad-p53/GM-CSF/B7-1的sko-007细胞可以明显抑制移植瘤生长,病理分析显示移植瘤纤维组织增生伴弥漫性坏死增多,血管增生显著。免疫组织化学染色显示瘤灶内有人T淋巴细胞浸润。结论: p53、GM-CSF和B7-1基因修饰的骨髓瘤细胞能够诱导产生抗肿瘤免疫反应,有可能用于人类多发性骨髓瘤的免疫治疗。

与内皮抑制素相互作用的蛋白及其抑制血管生成作用的分子机制

目的:探讨与内皮抑制素相互作用的蛋白,阐明其抑制血管生成作用的分子机制。方法:实验于2002-01/2004-12在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。应用酵母双杂交系统3,以内皮抑制素为诱饵,筛选人肝cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白。再利用一对一酵母回复性杂交、β-GAL实验和生物信息学分析技术筛除假阳性克隆。结果:成功构建稳定表达内皮抑制素基因的载体;酵母双杂交共获得281个克隆,经验证,6个为阳性克隆,测序发现其中一个克隆为未知序列;FASTCAT试验发现阳性克隆中4个克隆可明显的与内皮抑制素相互作用。结论:6个阳性克隆表达的蛋白可能能与内皮抑制素相互作用,并不同程度的参与了内皮抑制素调节的血管生成过程。

睫状神经营养因子的cDNA克隆、表达、纯化及其生物活性鉴定

反转录ＰＣＲ扩增人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏＰｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ后，克隆进ｐＢＶ２２０，在大肠杆菌中实现原核高效表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到分子量约为２４ｋＤ的预期表达产物，薄层扫描确定其表达量为２６％，制备电泳和凝胶过滤纯化后纯度达到９８％，生物活件分析表明，表达产物能刺激１０日龄鸡胚背根神经节细胞的生长，促进ＣＦＵ－ＧＭ的增殖。

辐射敏感细胞ku80基因突变及其DNA结合活性研究

RT PCR克隆辐射敏感细胞及其亲本细胞的ku80基因cDNA ,发现辐射敏感细胞的ku80基因与双链断裂DNA末端相互作用的位置存在基因突变 ,用凝胶阻滞和DNA 蛋白质印迹进一步证实突变ku基因编码蛋白结合双链断裂末端DNA的能力下降 。

鞘氨醇激酶活性测定方法的建立及其初步应用

目的:建立生物样品中鞘氨醇激酶(SPK)活性和1-磷酸鞘氨醇(S1P)含量的测定方法。方法:用Flag标记的SPK基因表达载体转染ECV304细胞,用Western blot方法检测转染后SPK基因的表达,用酶促反应、同位素掺入和薄层层析的方法检测SPK的活性。提取细胞或组织的S1P,碱性磷酸酶消化去除磷酸根,然后利用SPK的催化活性和同位素标记的方法对S1P进行定量。结果:转染基因后细胞的SPK表达明显升高,活性显著增强,细胞内S1P的含量也明显增多。肝细胞生长因子(HGF)刺激能增强ECV304细胞SPK的活性和细胞内S1P水平。结论:建立了SPK活性和S1P含量的测定方法。

激活Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

Notch是影响细胞分化的重要信号通路之一. RT-PCR检测到人骨髓来源的间充质干细胞(MSC)表达Notch1, 其配体Jagged1及下游分子DTX1, 表明Notch信号可能调节MSC的增殖分化. Notch1胞内区(ICN)是Notch蛋白的活性形式, 通过载体介导将ICN转染细胞就可以在没有配体存在的情况下激活Notch信号. 我们克隆了ICN基因, 构建了携带ICN的逆转录病毒载体, 感染MSC后用地塞米松(DEX)诱导其向成骨细胞分化. 转染ICN激活Notch信号的MSC较对照细胞在分化过程中碱性磷酸酶活力升高, 钙的沉积增加, 表明Notch信号有促进MSC向成骨细胞分化的作用.

酵母双杂交技术研究与内皮抑制素相互作用的蛋白质

目的 :应用酵母双杂交技术研究与内皮抑制素 (endostatin)发生相互作用的蛋白 ,有助于阐明其本身抑制血管生成作用的分子机制。方法 :应用酵母双杂交系统 3,以内皮抑制素为诱饵 ,筛选人肝cDNA文库 ,寻找能与之相互作用的蛋白。利用生物信息学技术 ,一对一酵母回复性杂交 ,β_GAL实验等提供的信息 ,筛除假阳性克隆。 结果与结论 :经过酵母双杂交共获得 2 81个克隆 ,经过验证 ,有 6个阳性克隆 。

IL-6对人多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用

目的 :鞘氨醇激酶是细胞内合成磷酸鞘氨醇的激酶。该酶是细胞迁移、增殖及凋亡调节中发挥重要作用的信号分子。本研究拟确定鞘氨醇激酶在人多发性骨髓瘤细胞的表达及在IL 6信号途径中的作用。方法 :采用RT PCR方法鉴定了鞘氨醇激酶在骨髓瘤细胞的表达情况 ,通过鞘氨醇激酶活性测定确定IL 6对多发性骨髓瘤细胞鞘氨醇激酶的激活作用。结果 :人多发性骨髓瘤细胞表达鞘氨醇激酶及S1P受体EDG 1,3,5。IL 6通过PI 3K和MAPK激活鞘氨醇激酶。结论 :在多发性骨髓瘤细胞中 ,鞘氨醇激酶参与IL 6的信号转导。

小鼠乳腺癌辐射敏感细胞SX-9的ku基因突变与辐射敏感性研究

目的 研究辐射敏感小鼠乳腺癌细胞SX 9的ku70、ku80基因型 ,初步探讨ku基因突变对其辐射敏感性的影响。方法 RT PCR克隆并鉴定ku70 /ku80全长基因 ,并对其全长进行全自动测序。脂质体转染正常人全长ku80cDNA至SX 9细胞 ,克隆形成比较转染了正常ku80基因的SX 9与SX 9以及SR 1细胞存活率。结果 SX 9细胞ku70基因正常 ,而其ku80存在基因突变 ,转染了正常人全长ku80cDNA的SX 9细胞能部分重建其对γ射线的存活率。结论 SX 9细胞ku基因发生突变 。

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ。

重组人Delta-like-1胞外区促进细胞因子对脐带血造血祖细胞的扩增

目的 :Notch信号通路对造血干 /祖细胞的增殖分化具有重要调控作用。Delta like 1(Dll 1)是Notch的配体之一 ,本研究观察了重组人Dll 1胞外区 (hDll 1ext)对细胞因子扩增脐带血造血祖细胞的促进作用。方法 :RT PCR用于检测Notch 1及其配体在脐带血细胞上的表达情况。利用免疫磁性分离 (MACS)的方法分离人脐带血CD34+ 细胞。在无血清培养体系中 ,hDll 1ext分别和不同的细胞因子组合联合培养CD34+ 细胞 ,通过集落形成实验检测hDll 1ext对造血祖细胞的扩增作用。结果 :RT PCR方法检测到脐带血单个核细胞表达Notch 1和它的配体Dll 1,Jagged 1,表明在生理条件下 ,脐血细胞的增殖分化可能受到Notch信号的调控。hDll 1ext能促进细胞因子组合对脐带血HPP CFC的扩增 ,其中hDll 1ext和SCF ,IL 3,IL 6联合的扩增作用最强 ,无血清培养 8,12d后 ,HPP CFC分别增加为培养前的 9.7和 4 3倍。结论 :重组hDll

人睫状神经营养因子的原核表达及其初步纯化

目的：优化条件实现人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的高效表达。方法：ＣＮＴＦ克隆进ｐＢＶ２２０后，表达，凝胶过滤纯化，１０日龄鸡背根神经节（Ｅ１０ＤＲＧｓ）测定其生物活性。结果：ＣＮＴＦ在ＨＢ１０１中高效表达，并具有生物活性。结论：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到相对分子质量约为２４×１０３的预期表达产物，优化表达条件后发现其在ＨＢ１０１中的表达状况最好。