低剂量氧化砷治疗早幼粒细胞白血病的实验研究

背景与目的:低剂量三氧化二砷(arsenictrioxide,As2O3)是治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)的有效手段之一,它不仅对初发APL病人有效,而且对全反式维甲酸(ATRA)已耐受的复发APL病人可获得完全缓解。然而,目前其诱导APL缓解的机制尚不清楚。为此,本研究试图探讨低剂量As2O3治疗APL的可能机制。方法:以APL细胞株NB4和来源于APL患者骨髓的原代细胞为模型,通过观察细胞形态、对四氮唑蓝的还原能力和细胞表面分化抗原的变化来鉴定细胞分化;并应用免疫荧光和Westernblot分析细胞内PML-RARα融合蛋白的变化。结果:0.25μmol/LAs2O3联合环腺苷酸(cAMP)拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-CPT-cAMP)可诱导NB4细胞和原代细胞分化,而且该效应能被蛋白激酶PKA的抑制剂H89抑制。进一步研究还显示8-CPT-cAMP可以促进As2O3介导的PML-RARα融合蛋白降解。结论:cAMP可增强As2O3对APL细胞的分化诱导效应。

PML-RARα对环腺苷酸诱导急性髓系白血病细胞分化的影响

为了进一步探讨环腺苷酸cAMP协同低剂量氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞分化的分子机制,以稳定转染了PML-RARα融合基因的PR9细胞为实验对象,通过观察细胞的生长,并利用形态学实验、流式细胞技术和荧光素酶报告基因转染实验等检测cAMP和/或氧化砷处理前后细胞相关指标的变化,研究PML-RARα在cAMP诱导AML细胞分化过程中的作用。结果显示,虽然cAMP单独能使表达PML-RARα的PR9细胞表面分化抗原CD11b的阳性率有所升高;但细胞形态学分析表明,cAMP单用无法诱导表达PML-RARα融合蛋白的PR9细胞分化,只有联合氧化砷才能使细胞表现出完全分化的特征,并伴有CD11b表达的显著升高。此外,PML-RARα还可以明显抑制含有cAMP反应元件的报告基因的转录。结论:PML-RARα融合蛋白对cAMP诱导AML细胞分化的信号转导途径具有显著的抑制作用。

环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP诱导分化效应的比较实验

目的:比较环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP在联合全反式维甲酸(ATRA)诱导耐药型早幼粒白血病细胞株NB4-R1分化中的作用。方法:将环磷腺苷和8-CPT-cAMP分别与ATRA联合处理NB4-R1细胞株,在不同时间点收集细胞,观察细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)的还原能力,以及细胞表面分化抗原CD11b的表达情况。结果:单独使用环磷腺苷或8-CPT-cAMP均无法诱导NB4-R1细胞分化;但8-CPT-cAMP可以恢复NB4-R1细胞对ATRA的反应性,8-CPT-cAMP与ATRA合用可以使NB4-R1细胞表面分化抗原CD11b的阳性率达到(86.5±7.78)%,与对照组和ATRA单用组相比均有显著性差异;同时,细胞对NBT的还原能力也明显升高,比对照组或ATRA单用组提高了5倍左右。而环磷腺苷与ATRA联合处理只能诱导NB4-R1细胞出现部分分化的特征,CD11b的阳性率可上升至(50.7±3.11)%,但细胞对NBT的还原能力却没有明显提高。结论:环磷腺苷对维甲酸耐药型细胞株NB4-R1细胞的分化具有一定的促进作用,但是效果明显不如其衍生物8-CPT-cAMP。

氧化酚砷诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞凋亡的研究

目的：了解氧化酚砷（phenylarsineoxide,PAO）对急性早幼粒细胞性白血病（APL）细胞系NB4细胞的可能作用。方法：在台盼蓝排除法计数活细胞和细胞活力的基础上，通过细胞形态学和流式细胞仪检测细胞凋亡。通过对细胞进行Rhodamine（Rh）123和碘化丙啶双重染色，并应用流式细胞仪检测其荧光强度，以反映细胞线粒体跨膜电位（△Ψm）。结果和结论：低浓度（005和0．1μmol／L）的PAO明显抑制NB4细胞的生长，并显著降低其细胞活力。进一步地，细胞形态学观察和流式细胞仪分析显示，这些浓度的PAO诱导NB4细胞凋亡。该效应可能与△Ψm下降密切相关。

全反式维甲酸诱导Rig-g基因表达的调控机制研究

为了揭示全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中rig-g基因表达的分子机制,进一步阐明ATRA在APL细胞分化中的信号转导网络,采用荧光素酶报告基因试验、蛋白质免疫共沉淀试验以及染色质免疫共沉淀试验等对直接启动rig-g基因表达的转录因子及其作用机制进行研究。结果显示:在NB4细胞中,STAT2、IRF-9和IRF-1均能够被ATRA诱导表达,但表达时相有所不同。STAT2和IRF-9可以发生相互作用,形成复合物,并与rig-g基因启动子上的序列结合,激活rig-g基因的表达。IRF-1单独也能激活含rig-g基因启动子的报告基因,但是C/EBPα能强烈抑制IRF-1的这种转录激活作用。结论:在维甲酸诱导APL细胞分化过程中,ATRA首先诱导IRF-1的表达;随着C/EBPα的逐渐下调,IRF1-继而又进一步使细胞内的IRF-9和STAT2的蛋白水平上升。IRF-9和STAT2相互作用形成的复合物是直接诱导rig-g基因表达最基本的转录因子。本研究对于深入理解ATRA诱导APL细胞分化的信号转导网络具有一定的意义。

氧化酚砷对血液肿瘤细胞系的体外效应

目的：了解氧化酚砷（Ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ， ＰＡＯ）对血液肿瘤细胞系的影响。方法： ８种血液肿瘤系经０．０１μｍｏｌ／Ｌ、０.０５μｍｏｌ／Ｌ和０．１μｍｏｌ／Ｌ的ＰＡＯ处理达一定时间后，经台盼蓝排除法计数细胞活力和应用流式细胞仪检测细胞ＤＮＡ含量分布。结果和结论：在生长抑制和诱导凋亡方面，ＰＡＯ对血液肿瘤细胞的效应谱相对较广，０．０５μｍｏｌ／Ｌ和０．１μｍｏｌ／Ｌ的ＰＡＯ能抑制某些血液肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡。但是，不同来源的血液肿瘤细胞系对ＰＡＯ的敏感性不完全相同。

环腺苷酸拟似物8-CPT-cAMP诱导M2b型急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞分化的研究

为了解环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-CPT-cAMP)对M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)细胞的作用,以AML-M2b细胞株Kasumi-1细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、表面分化抗原、细胞周期分布以及对四氮唑蓝的还原能力的改变,研究8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞增殖及分化的影响,并应用半定量RT-PCR和Western blot检测药物处理前后Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合蛋白的变化。结果发现,8-CPT-cAMP(200μmol/L)可明显抑制Kasumi-1细胞增殖而促使细胞趋向分化,但这种分化不是典型的完全终末性分化,8-CPT-cAMP对Kasu-mi-1细胞内AML1-ETO融合基因及其编码蛋白的表达无显著影响。结论:8-CPT-cAMP对AML-M2b细胞具有诱导分化效应。

DHL细胞中5-ALA代谢PpIX的双光子荧光光谱

双光子激发生物组织荧光,激发光仅作用于焦点区域,对生物样品的光漂白性和光毒性都很小,因而双光子荧光显微技术已成为细胞生物学研究的一种新技术。文章采用波长为820 nm飞秒激光激发孵育有5-ALA的DHL细胞,在激光扫描显微镜的Lambda模式中获得单个DHL细胞的双光子荧光光谱,并测量DHL细胞内积聚的卟啉九(PpIX)特征荧光值。获得了浓度分别为2,4和10 mmol.L-1的5-ALA溶液中,细胞代谢的PpIX含量随孵育时间的变化情况。DHL细胞内积聚的PpIX处于动态变化过程,并呈现出两阶段性的特点:细胞内积聚的PpIX含量随着孵育时间增长而增加,在3 h附近达到最大值,随后随着孵育时间增长反而下降。结果表明,基于激光扫描显微的双光子荧光光谱可成为DHL细胞等白血病细胞摄取5-ALA并生成PpIX的动力学研究的有效方法。

氧化砷诱导早幼粒细胞白血病细胞凋亡的体内研究

细胞凋亡已成为当前肿瘤研究的热点之一［１］，氧化砷和硫化砷等砷化合物治疗急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）为促进凋亡治疗恶性肿瘤这一新的治疗途径提供了成功的范例［２］。我院自１９９４年１２月起应用三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗了３６例ＡＰＬ复发的患者，其中...

硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡机制的深入研究

本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡的机制。通过细胞计数检测细胞增殖,用流式细胞仪分析细胞周期和活性氧(ROS)水平,Western blot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。结果表明,10 nmol/L硼替佐米联合50 nmol/L阿糖胞苷对U937细胞有明显增殖抑制作用。两药联合协同诱导细胞凋亡。两药联合较单药处理能明显协同增加U937细胞ROS的水平,并能明显上调U937细胞中p-P38,p-JNK表达,下调p-ERK的表达。结论:硼替佐米联合阿糖胞苷协同诱导U937细胞凋亡,其机制可能与ROS的损伤导致JNK、P38通路的激活和ERK的下调,从而影响细胞线粒体途径有关。

8-氯腺苷酸诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

本研究探究8-氯腺苷酸对多发性骨髓瘤细胞的可能作用。以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞为体外模型,在观察8-氯腺苷酸对细胞生长、活力及形态学影响的基础上,应用流式细胞术检测细胞DNA含量分布和细胞表面Annexin-V的含量,以DNA凝胶电泳技术评判细胞凋亡与否,并应用Western blot检测药物处理前后细胞内细胞周期调控蛋白cylinE和CDK2的变化。结果表明:低浓度8-氯腺苷酸(1-30μmol/L)能够明显地抑制RPMI8226细胞的生长,显著降低其细胞活力,且呈时间和浓度依赖性。进一步细胞形态学观察、流式细胞术及DNA凝胶电泳分析显示,这些浓度的8-氯腺苷酸诱导RPMI8226细胞凋亡。Western blot检测表明,8-氯腺苷酸可通过影响细胞周期调控蛋白cylin E和CDK2的表达而干扰细胞增殖。结论:8-氯腺苷酸能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞生长并诱导其凋亡。

急性白血病34例免疫分型与疗效关系

目的 :采用单克隆抗体 (Mc Ab)和流式细胞仪 (FCM)检测 34例急性白血病 (AL)的免疫表型。结果 :所检测的各种抗原的阳性表达率依次为 CD33>CD1 3 >CD1 1 b>CD1 4 ,干 /祖细胞分化抗原 CD34的表达率为 2 6 .9% ,M3 不表达 CD34和 HL A-DR。CD34+的完全缓解 (CR)率明显低于阴性组。表明免疫表型的研究将有助于指导临床治疗及判断预后。

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZF-RARα阳性U937细胞分化

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)和全反式维甲酸(ATRA)对PLZF-RARα阳性细胞的作用.方法:稳定转染PLZF-RARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经TSA,ATRA作用一段时间后,Wright-Giemsa染色观察细胞形态,MTT法检测细胞生长和增殖状态,流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b,CD64,CD14等的表达,荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达,细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况.结果:U937/PLZF细胞在去除四环素条件培养后,PLZF-RARα表达明显增加.TSA(30μg/L)联合ATRA(1μmol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小,生长增殖受抑,S期细胞减少,CD11b表达增高,PLZF-RARα蛋白表达减弱,分布以胞核弥漫细小颗粒为主,细胞功能上的分化可能尚不成熟.结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使U937/PLZF细胞发生部分分化.

三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞的影响

目的 :了解多发性骨髓瘤细胞对As2 O3 的反应及其可能机制。方法 :使用多发性骨髓瘤细胞系RPMI82 2 6和U2 6 6细胞作为体外模型。细胞凋亡经细胞形态学、流式细胞仪和DNA凝胶电泳判定。通过测定细胞内荧光染料Rhodamine 12 3的染色强度分析线粒体跨膜电位 (ΔΨm) ,并采用蛋白印迹分析蛋白剪切情况。结果 :不同浓度的As2 O3 对RPMI82 2 6和U2 2 6细胞产生不同的效应 :0 1～ 0 5 μmol/L的As2 O3 抑制其增殖 ,2 0 μmol/L的As2 O3 诱导其凋亡 ,而 1 0 μmol/L的As2 O3 在抑制细胞增殖的同时轻度诱导细胞凋亡。As2 O3 诱导的MM细胞凋亡伴随线粒体ΔΨm下降和caspase 3的活化。结论 :As2 O3 具有一个相对较广的诱导凋亡效应谱 ,而线粒体ΔΨm破坏是As2 O3

槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的作用及机制研究

目的:探讨槲皮素对慢性髓系白血病伊马替尼耐药细胞株的生长抑制作用及其机制。方法:台盼蓝染色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:25μmol/L槲皮素对伊马替尼耐药的K562细胞株K562R和K562G具有与伊马替尼敏感细胞株K562相似的生长抑制和诱导凋亡作用,且不改变BCR-ABL的表达水平。25μmol/L槲皮素处理24 h后,K562、K562R和K562G细胞的G_2/M期百分比明显增加。槲皮素能使γ-H2AX水平明显增高,且上调JNK的磷酸化水平。结论:槲皮素单药对伊马替尼耐药细胞株具有生长抑制和诱导凋亡作用,使细胞停滞于G_2/M期,其机制可能与上调JNK磷酸化水平导致DNA双链损伤相关。

异基因外周血造血干细胞移植后细胞免疫的重建

目的 研究异基因外周血造血干细胞移植后细胞免疫的重建，探讨免疫治疗应用于造血干细胞移植后的残留病灶清除，并将其与化疗有机结合，以延长患者无病生存率的方法。方法 采用流式细胞仪，检测14例异基因外周血造血干细胞移植患者移植前后外周血中T、B、NK细胞的含量。结果 异基因外周血造血干细胞移植后1月内，患者血循环中CD3^＋细胞明显减少，至移植后3月逐渐恢复至正常；CD3^＋CD4^＋细胞移植后持续减少，至移植后6月甚至更长时间后才逐渐恢复；CD3^＋CD8^＋细胞于移植后1月内很快恢复。CD19^＋细胞于移植后l～3月降低，移植后3～6月逐渐恢复。NK细胞于移植后2月恢复，较T或B淋巴细胞恢复速度快。结论 异基因外周血造血干细胞移植后3月T细胞才逐渐恢复至正常水平；B细胞于移植后1～3月绝对及相对计数降低，移植后3～6月逐渐恢复；NK细胞于移植后2月恢复，较T或B淋巴细胞恢复速度快。

硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷诱导U937细胞凋亡的研究

本研究探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合低浓度阿糖胞苷(Ara-C)对U937细胞株的作用及机制。通过细胞计数,细胞形态学检查,流式细胞术和Western blot方法检测硼替佐米(10 nmol/L)和(或)Ara-C(50 nmol/L)处理前后U937细胞的增殖抑制和凋亡及其机制。结果显示,硼替佐米和Ara-C单药均能抑制U937细胞增殖,两药联合的抑制作用更加明显,细胞增殖抑制率在24和48 h分别达(55.00±2.81)%和(70.02±3.33)%;硼替佐米联合低浓度Ara-C能协同诱导U937细胞凋亡,促使线粒体跨膜电位下降,阳性细胞率达(38.70±1.54)%。两药联合应用还能协同诱导caspase-9,-8,-3的活化。结论:硼替佐米联合低浓度Ara-C主要通过线粒体途径、可能还通过死亡受体途径诱导U937细胞凋亡。

CAG方案对U937细胞株作用的体外研究

目的研究CAG方案,即重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)+阿糖胞苷(Ara-C)+阿柔比星(ACR)对U937细胞株的作用。方法以rhG-CSF(50ng/mL)、Ara-C(10nmol/L)和ACR(10nmol/L)单用或联用分别处理白血病细胞株U937,分别设为对照组(未加任何药物)、Ara-C组、rhG-CSF组、ACR组、rhG-CSF+ACR组、Ara-C+ACR组、Ara-C+rhG-CSF组及Ara-C+rhG-CSF+ACR(CAG)组。采用细胞计数仪计数并计算各组细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD11B表达、细胞凋亡率及细胞周期的改变情况。结果在含Ara-C各组(Ara-C组、Ara-C+ACR组、Ara-C+rhG-CSF组和CAG组),加药后第1天,S期细胞百分比低于对照组。加药后第2天,细胞生长受到明显抑制,CD11B表达显著上调,其中CAG组显著高于Ara-C组(P<0.05);加药后第6天,细胞形态呈现部分分化,CAG组细胞分化特征尤为明显。各组细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 CAG方案可诱导U937细胞分化,而且随着加药时间的延长,细胞的分化更加明显。

STUDY ON THE RELATIONSHIP OF ARSENIC TRIOXIDE-INDUCED BIOLOGICAL EFFECTS AND DEGRADATION OF PML PROTEINS

Objective: To understand whether arsenic trioxide (As2O3 )-induced biological effects are associated with degradation of PML proteins. Methods Acute promyelocytic leukemia (APL) cell line NB4, acute T-lymphocytic leukemia cell line Jurkat, acute myeloid leukemia cell line U937, and chronic myelocytic leukemia blast crisis cell line K562 were used as in vitro models In different cell lines, the As2O3-induced biological effects were determined by cell growth, cell viability, cell morphology, and flow cytometry assay on sub G1 cell content. The alteration of PML proteins was analyzed by immunofluorescence Results in terms of growth inhibition and apoptosis induction, 1. 0μmol/L As2O3 had different effects on different cell lines. However, degradation of PML proteins occurred in all the cell lines with As2O3 treatment. Conclusion As2O3-indued biological effects may be independent of PML protein-degradation.