杂化纳米生物催化剂CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8的构建及性能

以脂肪酶(lipase,CALB)为模型酶,利用功能性纳米材料四氧化三铁纳米粒子与金属有机骨架(metal-organic framework,MOF)材料ZIF-8相杂化的同时,将CALB包埋在杂化材料中,制备杂化纳米生物催化剂CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8,研究了温度、机械搅拌转速、光照条件以及Fe_(3)O_(4)添加量对CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8活性的影响,获得制备CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8的最佳条件为:温度20℃、转速400 r/min、光照波长380 nm、Fe_(3)O_(4)质量5 mg。在此条件下CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8的最大酶活回收率82%,比优化前提高了16%。随着具有光热效应的Fe_(3)O_(4)纳米粒子的加入,CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8表现出较强的光热效应,光照(光强和光照波长)显著提高酶与底物的亲和力和反应速率,使CALB@Fe_(3)O_(4)@ZIF-8表现出更高的酶活力。该研究为开发新型功能性纳米杂化MOF固定化酶生物催化剂提供参考。

多元介孔MOFs:通过调节表面亲水/疏水性实现酶固定化的多功能平台

作为高效的生物催化剂,酶在食品加工、医药制造、化学工业和能源开发等众多领域发挥着重要作用.然而,游离状态的酶由于存在稳定性差、易失活、难以回收利用及不适用于连续化生产等问题,限制了其广泛应用.为了解决上述难题,人们探索发展了固定化酶技术.固定化酶不仅保留了原有的催化活性,而且在稳定性方面有了显著提升,从而极大地提高了酶的利用效率.随着固定化酶材料和酶工程领域的不断发展,固定化酶技术为酶的应用开辟了更广阔的前景.沸石-咪唑骨架材料-8(ZIF-8)作为一种金属-有机骨架(MOFs)材料,因其独特的结构特性而被广泛用作酶固定化载体.然而,ZIF-8的微孔结构和固有的疏水性,以及前体物2-甲基咪唑(2-MeIm)的质子化现象,常常影响固定化酶的活性.为克服这些限制,本文采用多元配体竞争和孔隙工程相结合的策略,设计并制备了一种具有可调节亲水/疏水表面的新型多元介孔MOFs(mMOFs),并用作酶固定化载体.在mMOFs的制备过程中,采用亲水性和配位能力更强的3-甲基-1H-1,2,4-三唑(3-MTZ)和5-甲基四唑(5-MTA)配体,以部分替代传统的2-MeIm配体.随后,这些多元配体(包括2-MeIm,3-MTZ和5-MTA)与七水硫酸锌结合,在甲醇溶液中通过自凝聚作用形成透明的胶体溶液,进而完全溶解在水中.在此过程中,七水硫酸锌发挥了软模板的作用,引导介孔的形成,从而成功制备出新型多元介孔mMOFs.接着,利用这些mMOFs作为酶固定化的载体,固定了辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOx),并详细研究了其催化性能.结果表明,与传统的ZIF-8载体相比,以mMOFs为载体的固定化酶展现出了更高的酶活性和稳定性.催化性能提升主要归因于mMOFs的亲水性和介孔结构改善了酶和底物间的传质,同时2-MeIm的质子化效应减弱也为酶提供了优良的微环境,稳定了酶的构象.综上,本文采用多元配体竞争与孔隙工程相结合的策略,成功构建了一种具有可调节亲水/疏水表面的新型多元介孔mMOFs,并用于酶固定化,所得固定化酶表现出较好的催化性能.通过深入的研究,揭示了该固定化酶表现出良好催化性能的作用机制,为可控设计制备性能优越的、以MOFs为载体的固定化酶提供了新思路,并为进一步拓宽MOFs材料的应用范围提供了参考.

复合诱变条件优化结合过表达乳酸脱氢酶高效合成苯乳酸

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)作为新型生物防腐剂苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)的天然生产菌,在自然界中普遍存在,但由于其胞壁较厚、机械强度较大,导致外源基因难以导入。为使LAB自身高效合成PLA,该研究以实验室筛选的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici GM)作为出发菌株,采用复合诱变选育出活力更高、产量更大的突变菌株,即先采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变50 s,再采用0.8%硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)诱变25 min,并在培养基中加入PLA以提高菌株抗性,进行摇瓶发酵验证和遗传稳定性验证。为解决外源基因难导入的问题,使外源DNA得到高效转化,该研究通过单因素试验对氨基酸、缓冲液、溶菌酶、菌体生长状态和电转化参数进行优化,得到最优电转化条件:添加0.75%L-苏氨酸的MRS培养基培养菌体至OD600=0.8,使用洗涤缓冲液Ⅲ(0.5 mol/L蔗糖,7 mmol/L Na_(2)HPO4,7 mmol/L NaH_(2)PO_(4),20 mmol/L MgCl_(2))洗涤菌体,溶菌酶浓度30 mg/mL于37℃处理菌体30 min,电场强度20 kV/cm。为进一步提高LAB合成PLA的产量,本研究利用基因工程手段,将质粒载体pMG36e自带启动子P32(强度低)替换为Pldh(强度高),构建L型乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)过表达质粒,并在最优电转化条件下成功转化于P.acidilactici GM中,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析表明LDH基因ldh表达上调,经过5 L罐发酵培养,添加苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)后,PLA产量提高至56.3 g/L,转化率提高至94.8%。

纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素(natamycin)高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus TUST01)作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量(5.95 g/L)与生物量(29.19 g/L)较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。

以泉香型白酒为酒基的秋梨杏仁露酒设计及风味研究

为了了解以泉香型白酒为酒基的植物类露酒的风味物质,该研究首先通过单因素与正交试验设计相结合的方法优化秋梨杏仁露酒勾调工艺,再采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)分析方法对秋梨杏仁露酒中的挥发性风味化合物进行分析,利用相对香气活度值(ROAV)筛选出特征挥发性风味化合物,并与基酒比较。结果表明,秋梨杏仁露酒的最佳勾调工艺为杏仁浸提液7%、玉竹浸提液5%、枸杞浸提液6%、秋梨蒸馏液8%。在此优化条件下,秋梨杏仁露酒香气淡雅,层次突出,口感绵柔,酒体饱满,感官评分为90分。秋梨杏仁露酒样品共检出80种主要挥发性风味化合物,其中有25种特征风味化合物。与基酒相比,新增酯类、醇类、酸类、醛类、酚类和酮类的数量分别为20种、7种、5种、5种、4种和4种。秋梨杏仁露酒的重要贡献香气物质(ROAV≥10)共12种构成该露酒的香气骨架,而苯甲醛和异戊醛是该款露酒特有香气贡献化合物。

白酒发酵过程中高级醇影响因素的研究

该研究采用实验室模拟白酒固液发酵,研究酒曲种类、粳高粱产地、加曲量、微生物与大曲共同发酵几方面对白酒中高级醇含量的影响。结果表明,固态发酵的大曲酒高级醇总含量比小曲酒高28.2%。用小曲进行液态发酵,东北粳高粱发酵1 d所产高级醇含量比山西粳高粱高3.5倍,总高级醇含量相差最大。小曲在山西高粱汁中进行液态发酵,曲料比在2%(质量分数,下同)时产高级醇含量最少,比在4%时(最高产量)低98.4%。大曲与微生物在山西粳高梁汁中液态发酵时,大曲、米曲霉Q-1、酿酒酵母N-1和异常威克汉姆酵母J-1共同发酵时比3种菌株混合发酵时产异戊醇、异丁醇和正丙醇的含量分别降低了53.88%、47.77%和88.57%,比大曲、酿酒酵母N-1、异常威克汉姆酵母J-1混合发酵时的异戊醇和异丁醇的含量分别增加了73.79%和60.30%,说明米曲霉Q-1在其中对高级醇的产生起到了促进作用,3种菌株(Q-1,N-1,J-1)混合发酵与2种酵母一起发酵相比,所产异戊醇、异丁醇分别降低了5.17%和4.20%,正丙醇增加了1.96%,说明米曲霉Q-1对2种酵母(N-1,J-1)混合发酵产高级醇没有显著影响。

高粱品种对白酒发酵的影响

高粱品质的优劣决定了白酒的质量。该研究对5个产地高粱的理化指标进行主成分分析,发现糯高粱间理化指标相近,而粳高粱间相差较大。通过偏最小二乘判别分析确定重要差异标记物(预测值的可变重要性,variable importance in projection,VIP>1.5),定量为乙酸乙酯、甲醇等7种物质。东北、山西2种粳高粱所产白酒乙酸乙酯、甲醇含量均高于湖南、四川、贵州糯高粱所产白酒。使用不同粉碎度高梁生产白酒,全粉碎高粱组(整碎比为0∶10)乙酸乙酯含量高出全整粒高粱组(整碎比为10∶0)1.39倍。全整粒高粱产白酒的甲醇含量比全粉碎高粱组高74.26%。乙醛、乙缩醛和高级醇含量在全粉碎高粱组均为最高。对比酵母对粳、糯高梁汁的利用情况,酿酒酵母在液态发酵3 d时产乙酸乙酯含量差异最大,粳高粱是糯高粱2.56倍。发酵7 d时异常威克汉姆酵母产乙酸乙酯含量差异最大,粳高粱是糯高粱的2.48倍。2种酵母在发酵7 d时产高级醇差异均为最大,酿酒酵母和异常威克汉姆酵母在糯高粱汁中发酵产高级醇分别比粳高粱高74.37%和58.21%。

非酿酒酵母Nakazawaea ishiwadae GDMCC 60786产乙酸乙酯的诱变菌株筛选及其安全性评价

为提升Nakazawaea ishiwadae GDMCC 60786产乙酸乙酯的能力,通过物理诱变常压室温等离子体和化学诱变甲基磺酸乙酯、亚硝基胍筛选突变菌株。利用三丁酸甘油酯初筛、摇瓶发酵二筛和外加底物发酵三筛。同时,对突变菌株进行遗传稳定性、溶血性和耐药性体外安全性评价。结果表明:对出发菌株进行诱变处理,最终获得1株高产乙酸乙酯、遗传稳定性良好及体外安全性良好的突变菌株N5,将该诱变菌连续传代5次,得到乙酸乙酯含量的平均值为764.52 mg/L,葡萄糖转化率达到38.22%,与出发菌株相比,乙酸乙酯提高了1.90倍,葡萄糖转化率提高了25.03%。外加乙醇后,突变菌株N5乙酸乙酯质量浓度为1426.81 mg/L;但外加乙酸后,该菌株不生长,并失去产酯能力,表明其对乙醇耐受性强于乙酸。同时发现24 h时,突变菌株N5的酯酶、乙酰辅酶A和醇酰基转移酶活性均达到最大值。本研究构建了一套适用于该菌株的诱变体系。

发菜伴生细菌的分离鉴定及其对发菜生理代谢的影响

为了探究发菜(Nostoc flagelliforme)伴生菌对其生理代谢的影响,进一步了解发菜的生长体系以及发菜与伴生菌的相互作用,本文采用平板划线法从发菜固体培养基上分离出11株伴生菌,利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-qToF-MS)鉴定伴生菌产生的N-酰基高丝氨酸内酯类分子(AHLs)种类.通过质谱图可知微杆菌属(Microbacterium sp.)ABNF-1产生C_(12)-HSL,根瘤菌属(Rhizobium sp.)ABNF-4产生C_(6)-HSL、C10-HSL、C_(12)-HSL,戈登氏菌属(Gordonia sp.)ABNF-9产生C_(6)-HSL、C10-HSL,假单胞菌属(Pseudomonas balearica sp.)ABNF-10产生C10-HSL、C_(12)-HSL.对发菜AHLs产生菌共培养的代谢产物分析表明,主成分分析(PCA-X)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)的评分都呈现明显的离散现象,表明共培养组的代谢产物发生了变化,发菜的脂肪酸代谢和碳代谢发生了显著变化.通过外源添加AHLs发现,当群体感应信号分子AHLs浓度为5μmol/L以上时,AHLs能够促进荚膜多糖的积累,提高细胞总糖含量,对发菜多糖含量影响显著,这进一步说明AHLs能够影响发菜细胞的生长代谢.

不同催陈方法对酱香型白酒的催陈效果

该试验采用气相色谱仪(gas chromatography,GC)和液液萃取-气相色谱-质谱(liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometry,LLE-GC-MS)联用技术测定催陈酒样白酒微量组分,结合感官品评及酒精度测定,对比电场催陈、超声催陈、介质吸附催陈和自振空化器催陈4种催陈方式对新酿白酒催陈的效果。结果表明,活性炭吸附处理和电场处理对新酿白酒风味有较大改善,感官评分优于原酒样。电场处理24 h为最优催陈处理方式,处理后酒体中酯类物质含量增加7.54%,乙酸乙酯和乳酸乙酯两种主要酯类含量分别增加6.07%和7.18%。

高产聚苹果酸黑色素短梗霉CGMCC18996全基因组组装注释及关键蛋白分析

通过PacBio Sequel II及Illumina NovaSeq 6000测序平台对高产聚苹果酸(polymalic acid,PMLA)产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)基因组进行测序,对测序得到的下机文件进行组装,并结合转录组数据进行基因结构注释。结果表明,产黑色素短梗霉基因组中共有6202个基因,主要参与碳水化合物转运及代谢、氨基酸转运代谢、转录后修饰、RNA加工及修饰等生物活动。功能注释结果显示基因组中有大部分基因与过氧化物体有关,进而对菌株进行透射电镜拍摄,发现菌体中存在圆形的类过氧化物体(乙醛酸体)结构,提示菌体可通过乙醛酸循环途径生成苹果酸。最后,对可能与PMLA合成有关的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶和苹果酸合成酶进行了蛋白质结构预测,发现这两种蛋白可能具备合成苹果酸的能力。本研究结果可为产黑色短梗霉菌株的PMLA代谢提供一定的参考,同时,组装的基因组文件已上传至相关数据库,为后续的菌株开发利用提供基础。

新型生物材料——细菌纤维素

简要介绍细菌纤维素的基本性质 ,系统地介绍了细菌纤维素的生物合成与调节、发酵工艺条件控制和在造纸、食品。

细菌纤维素结构与性质的初步研究

对A. xylinum X-2的发酵产物进行纤维素酶水解液的纸层析实验,发现样品的Rf值与标准葡萄糖液的Rf值相近,水解液主成分为葡萄糖。通过对细菌纤维素的的X-射线衍射图谱和固体CP/MAS 13C-NMR谱分析,表明细菌纤维素结晶度高,Iα/Iβ比例大。对细菌纤维素干膜进行渗透性实验,发现干膜透气性小,透湿性大,结构致密,含有大量极性基团。

ε-聚赖氨酸高产菌株的选育

依据传统诱变理论和白色链霉菌生物合成ε 聚赖氨酸的特点 ,确立了以枯草芽孢杆菌为敏感菌株 ,抗性突变株筛选和抑菌圈法相结合的初筛方法。在优化诱变条件的基础上 ,以白色链霉菌为出发菌株 ,经紫外线与硫酸二乙酯诱变 ,选育出一株遗传性状稳定 ,遗传标记为AECr+Glyr的ε 聚赖氨酸生产菌株 ,其产量可达 0 79g/L。

细菌纤维素在草浆纸中应用的探讨

利用电子显微镜观察了细菌纤维素的微观结构 ,其为典型的空间网络结构。利用显微镜观测纤维素湿膜打浆分散成单根纤维的横断面形态 ,末端呈锯齿型 ,其有利于纤维的分丝帚化。在浆料中加入细菌纤维素能够有效地提高填料的一次留着率。在苇浆中加入 1 0 % (g/g)的细菌纤维素可提高裂断长 2 2 % ,耐破指数 8% ,撕裂指数 5 %。

气升式生化反应器提高衣康酸产酸率的研究

测定了气升式生化反应器的相关参数,建立了相应的传氧方程。采用不同生化反应器进行衣康酸发酵．结果表明，采用气升式生比反应器与机械搅拌罐相比，提高产酸14％，提高转化率16％，生产能力提高38％。

超临界CO_2对面包酵母活性影响的研究

超临界CO2 下面包酵母菌株的存活率 ,随菌体含水量的增加、在超临界CO2 流体中停留时间的延长和压力的增大而逐渐降低 ;当CO2 的降压速率为 0 2 5MPa min时 ,酵母菌的存活率最高。结果表明 ,在超临界CO2 条件下导致酵母菌死亡的主要原因是压力的快速变化与低pH值。

蓝色梨头霉菌体形态与生物转化率关系研究

研究了蓝色梨头霉菌丝球形态与产率的关系 :摇床转速为 170r min、pH值为 6 5、底物添加量为 0 1%、单位体积孢子数为 1× 10 7个 mL、(NH4 ) 2 SO4 质量分数为 0 9%～ 1 8%、采用回转式的培养方法时 ,菌体直径一般在0 79～ 1 39mm ,且菌丝缠绕不过于紧密 ,菌丝球边缘菌丝较长 ,各球体之间较独立 ,此时转化率为 5 1%～ 5 6 4 %。

添加氧载体提高泰乐菌素发酵的得率

通过添加氧载体（如正十二烷、全氟化碳等），提高了发酵系统中的氧传递速度，从而促进了泰乐菌素的生物合成。当加入５％的正十二烷或全氟化碳，泰乐菌素的生成量分别提高１４％和８％；在加入正十二烷和全氟化碳的同时，再加入载体Ａｉｄ—ＰｌｕｓＭＬ—５０Ｄ，可使泰乐菌素的生成量分别提高１９％和２０％。

衣康酸发酵工艺的初步研究

以土曲霉为出发菌株，探讨了衣康酸发酵工艺条件对产酸的影响。结果表明：以葡萄糖为碳源，ＮＨ４ＮＯ３为氮源，玉米浆为辅助碳源有利于提高产酸。Ｍｇ２＋能促进菌体生长和发酵产酸，Ｐｂ２＋和Ａｌ３＋抑制菌体生长及产酸。Ｍｇ２＋可以解除Ｐｂ２＋和Ａｌ３＋对产酸的抑制作用。Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋等对产酸影响不明显。