HCVNS3基因片段酵母展示文库的构建和鉴定

HCV NS3特异的 CD4+T细胞反应与 HCV感染的良性转归相关 .为了筛选其 CD4+T细胞表位 ,构建了 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .首先 DNase 不完全酶切 HCV NS3基因产生长度为 1 0 0～ 30 0 bp的随机片段 ,然后在它们两端加上含限制性内切酶 Bam H 作用位点的接头 ,再以接头序列作引物进行 PCR扩增 .最后扩增产物用 Bam H 酶切后与 Bam H 线性化的穿梭载体 p YD1连接 ,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5α,共得到 2× 1 0 6个转化子 .转化菌落的 PCR扩增结果表明 ,约 50 %转化子含插入片段 .随机选择 5个插入片段测序 ,然后与 DNA序列数据库中的序列比较 .结果显示它们分别与 HCV NS3序列有 96%～ 99%的同源性 .用从转化菌落中提取的质粒转化酵母 (S.cerevisiae)菌株 EBY1 0 0 ,得到含 2× 1 0 5个插入片段的 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .半乳糖诱导的酵母细胞通过和 FITC标记的抗体结合 ,用 FACS可以在 2 0 %的细胞表面检测到融合蛋白的表达 .

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的:用肝组织特异性启动子,实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1-6中的稳定表达。方法:从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA,用随机引物合成cDNA的第1条链,然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增,克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基 因的正确序列,连接到肝特异性启动子的下游,使CD81基因的3’端与SV40 polyA加尾序列融合,得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中,转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6。经G418加压筛选后,分别用RT-PCR检测人CD81 mRNA的转录,用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果:克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明,得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞,并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论:由于CD81是HCV的感染受体,稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得,为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物,以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。

水动力转染基因在小鼠体内的长期高效表达

水动力转染技术是近年新出现的一种体内基因转染方法,可以实现目的基因在小鼠体内的高效表达,有可能作为受精卵显微注射的一种简单替代技术。但该技术的缺点是转染基因多瞬时表达,外源基因在体内高效表达的时间通常不超过1周,而且局限于肝、肾等器官,从而限制了该技术广泛应用。为了延长水动力转染基因在小鼠体内长期高效表达的时间,从而能对目的基因的体内功能进行长期研究,国外研究者进行了广泛的探索,本文综述了相关研究的最新进展。

HCV抗原表位预测

应用网络生物信息资源查找丙型肝炎病毒基因组全序列 ,用软件Lasergene中的EditSeq将来自中国河北株mRNA序列翻译为氨基酸序列 ,尔后用程序Protean进行氨基酸序列分析 ,对HCV各区段的B细胞抗原指数进行预测。同时又在两个网站对中国汉族人中频率较高的HLA基因型进行CD8和CD4T细胞表位预测。

小鼠白蛋白启动子的组织特异性功能研究

以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动GFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究。结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和人肝癌细胞系HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。Hepa1-6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍。G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1/2。转染人肝癌细胞系HepG22周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA801中表达。以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性。

应用水动力转染技术使人低密度脂蛋白受体、CD81和浸入诱导蛋白L同时在小鼠体内表达

为建立人低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD81和浸入诱导蛋白L(Sip-L)等多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,首先分别构建了白蛋白启动子调控的人LDLR、CD81和Sip-L基因的小鼠肝脏组织特异性表达载体,将3种质粒同时采用水动力转染技术导入小鼠体内,RT-PCR和免疫组化技术检测转入体内基因的表达及持续时间。结果表明,转染8h后即可检测到3种基因在体内转录,人LDLR和CD81在转染1～4d后可在50%～90%的肝细胞中高效表达,7d后检测不到目的基因表达。为了进一步延长转染基因在小鼠体内的表达时间,又分别构建了人LDLR、CD81和Sip-L的染色体整合型表达载体,将它们与噬菌体ФC31的整合酶表达载体同时水动力转染小鼠,3种基因在体内表达时间可持续到转染后25d。以上结果表明建立了多个HCV感染相关分子共表达的转基因小鼠,为确定这些分子能否使小鼠感染HCV奠定了基础。

小鼠脂联素与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

以绿色荧光蛋白(GFP)基因(gfp)为报告基因,构建小鼠脂联素(mADPN)基因(mAd)与gfp的融合基因mAd/gfp表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd-gfp,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达可间接反映mADPN的表达,并通过RT-PCR在核酸水平进一步确证mAd的表达。荧光显微镜观察及RT-PCR结果均证明mADPN在COS-7细胞中获得了高效表达,表明mADPN重组表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd可以在真核细胞COS-7中高效表达mADPN,为进一步探讨mAd在小鼠体内的表达提供了可行性依据。

盐水法、微板法和微柱凝胶法检测O型血清中抗-A,抗-B效价的比较研究

比较用盐水法、微板法和微柱凝胶法检测O型血清抗-A,抗-B效价的可靠性及可操作性,选择一种检测大批量标本的可靠方法。使用盐水法、微板法和微柱凝胶法对同一组30例标本进行检测和比较。结果三种方法检测结果没有一致性,盐水法敏感性最低,微柱凝胶法敏感性最高,微板法的检测结果较为稳定。说明微板法适合进行大批量标本的抗体效价检测。

体外模拟的O型全血异型输注研究

为了研究异型输血时B型受者接受大剂量O型全血的血液流变学和红细胞记数、游离血红蛋白的变化,取刚采集的B型全血40mL中分别加入7.5、10.0、13.5、20mL抗B效价为1:64的O型全血,其量相当于60kg个体输入800、1200、1600和2400mL血液,然后置38℃孵箱,用摇摆器以60次/min摇动混匀。分别在0h、2h、4h、8h、16h、和24h留取标本,使用SA-6000血液粘度仪进行血液流变学检查。结果显示,游离血红蛋白和红细胞记数各组比较差异不显著,在切变率为5h,30h,200h时各组标本差异十分显著,提示细胞的变形性下降,但结果均在正常范围以内,说明抗-B效价为1:64以下的O型血可以不限量地给A/B型输用。

丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶瞬时表达小鼠模型的建立

目的:建立丙型肝炎病毒NS3/4A丝氨酸蛋白酶体内活性评价模型。方法:利用NS4A/B是NS3/4A丝氨酸蛋白酶作用底物的特性,构建融合基因NS3/NS4A/B-SEAP,底物片段NS4A/B插在NS3/4A和人分泌性碱性磷酸酶(SEAP)之间,融合基因表达后SEAP的分泌依赖于有活性的NS3/4A在NS4A/B位点的切割。将含融合基因的质粒NS3/4A(△4AB)SEAP通过水动力转染技术转染到小鼠体内,检测小鼠血清中SEAP的活性,高活性的SEAP是该评价体系成立的证据。结果与结论:在瞬时表达NS3/4A的小鼠血清中检测到了高活性的SEAP,建立了可用于评价抗NS3/4A的小鼠体内瞬时模型。

丙型肝炎病毒感染细胞的相关分子研究进展

病毒与细胞表面分子结合是病毒感染的前提。研究丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞的相关分子,对于阐明HCV的感染机制、预防和治疗丙型肝炎以及建立感染模型具有重要意义。近年来,该方面研究取得了一些重要进展,几种能介导病毒感染的细胞分子被相继发现,如低密度脂蛋白受体(LDLr)、CD81、GAGs和Sip-L等。本文旨在对这些细胞分子作一综述。

重组风疹病毒抗原的分离纯化

为了制备临床诊断用的风疹病毒抗原,建立了亲合色谱分离纯化的方法。风疹抗原以可溶性形式在大肠杆菌工程菌中获得高效表达,用GST亲合色谱在不变性的条件下直接从细菌裂解液中分离纯化。纯化的目的蛋白电泳为单一条带,ELISA试验表明,重组抗原与风疹病毒IgM阳性血清能特异反应,而与IgM阴性血清不反应,表明重组蛋白具有良好的抗原性,能满足临床检验要求。

膜锚定Gaussia萤光素酶的细胞标记及生物荧光成像

目的:制备表达膜锚定Gaussia萤光素酶(extGluc)报告基因的慢病毒,用于标记细胞。方法:将报告基因extGluc克隆至慢病毒载体pCCsin.PPT.SFFV.IRES.eGFP.Wpre(VeGFP)中,以聚乙烯亚胺(PEI)介导,将慢病毒包装所需4种质粒(pVeGFP-extGLuc、pMDL、pRev、pVSVG),转染293FT细胞,72 h后收集病毒上清进行浓缩,感染293FT细胞,并用流式细胞仪检测病毒滴度,生物荧光成像和化学发光分析extGluc的表达;之后,用收集的慢病毒感染人单核细胞白血病细胞株U937。结果:对经PCR筛选出的阳性克隆所含质粒进行酶切鉴定,表明extGlu报告基因插入载体中;重组慢病毒包装成功且病毒滴度为5×106 TU/mL;用包装的病毒颗粒感染293FT细胞,生物荧光成像和化学发光证实extGluc的膜定位,且酶活性与细胞数目呈线性相关;病毒颗粒能够感染悬浮细胞U937。结论:包装了extGluc标记的重组慢病毒,可用于标记细胞,为体内监测细胞迁移、聚集和变化提供了一种方法。

全国11城市的O型血液抗体效价调查研究

为了研究不同地区的O型血液中国人血清中的抗体效价是否有明显的差异和不同地区的抗体效价水平,对11个城市的O型血液抗体效价水平进行了检测。用全自动微板法,对调查的440份O型血抗-A、B抗体的IgM和IgG效价进行统计,表明IgM抗体效价较低,1:16出现的频次最高;IgG抗体效价较高,1:64出现的频次最高。各省市之间的抗体水平没有明显差异。

纳米通道技术及应用

纳米通道技术是近年来发展的一种直接解读核酸分子编码信息的新方法 ,它通过将单链核酸上的核苷酸序列直接转化为电信号 ,能以每秒超过 10 0 0个碱基的速度对其进行超快速序列分析 ,较现有测序方法更简便快速和省钱 .该技术除可用于核酸超快速外 ,还在病原体基因诊断、单核苷酸多态性和样品多成分的快速检测等多个领域有重要用途 .

酵母表面展示技术及应用

酵母表面展示是近年发展的一种新的蛋白表面展示技术 ,能够展示需糖基化作用、二硫键异构化等翻译后修饰才具功能活性的复杂真核蛋白。本文介绍了该技术的基本原理、研究进程、筛选方法。

真核蛋白表面展示系统

酵母表面展示和杆状病毒表面展示是近年来发展起来的新的蛋白表面展示技术,可用于展示需糖基化作用、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白。本文简述了该技术的基本原理、应用、研究进展及其发展前景。

HLA-DR分子的分离纯化

目的 :纯化HLA DR分子。方法 :纯化抗HLA DR单克隆抗体L2 4 3并与CNBr活化的Sepharose 4B偶联制备亲和柱 ,应用免疫亲和层析方法纯化HLA DR分子。结果 :从 5gHLA DR阳性的人B淋巴瘤细胞系RAJI裂解液中得到 2 0 μgHLA DR分子。它们以二聚体形式存在 ,能与构象依赖型单抗L2 4 3进行结合 ,煮沸变性后分开为α和 β两条单链。