大豆体细胞胚胎发生再生体系的建立与优化

以耐干旱、增产潜力大、抗病毒病、品质优良的晋豆19号大豆为材料,以子叶节、下胚轴、上胚轴、子叶、真叶为外植体,研究外植体类型、激素配比、接种方式等对再生频率的影响。结果显示:无菌苗刚转绿的下胚轴是诱导愈伤组织的最适外植体;诱导愈伤的最适培养基为MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D;诱导芽分化的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA;诱导根分化的最适培养基为MS+0.25 mg/L NAA。各种外植体中,诱导频率高低依次为下胚轴、上胚轴、子叶节、子叶、真叶。

基于独特型-抗独特型初步建立玉米赤霉烯酮无毒ELISA定量检测技术

目的:初步建立以玉米赤霉烯酮(ZEN)抗独特型单抗替代玉米赤霉烯酮标准品,检测ZEN残留的无毒ELISA定量检测技术。方法:以ZEN-BSA为包被原,ZEN单抗(1G4)为反应抗体,分别以不同浓度的ZEN毒素或ZEN抗独特型单抗1D5(Ab2β-1D5)为竞争物,建立竞争抑制曲线。根据抑制率在20%~80%间,在相同抑制率条件下,ZEN与1D5间浓度对应关系,绘制替代标准曲线及对应的浓度转换方程。以ZEN类似毒素代替ZEN作为竞争抗原,检验方法的特异性;板内、板间试验检验方法的精密度。结果:初步建立了ZEN无毒ELISA定量检测技术,1D5与ZEN毒素之间的替代标准曲线方程为:y=1.2846x1.9310(y为ZEN毒素浓度ng/ml,x为抗独特型抗体浓度(μg/ml)。检出限(IC2 0)为1.041 ng/ml,检测范围为1.041~25.99 ng/ml。方法的批内平均变异系数为3.88%,批间平均变异系数为4.96%。方法特异性好,与ZEN类似毒素几乎无交叉反应。结论:利用ZEN单抗和ZEN抗独特型单抗初步建立了ZEN的无毒ELISA定量检测方法。

抗玉米赤霉烯酮单抗独特型抗体制备与鉴定

目的:研制抗玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)单抗独特型抗体并鉴定其特性,为建立ZEN无毒检测方法提供理论依据。方法:在研制抗ZEN单抗的基础上,将IgG与KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,制备抗ZEN单抗独特型抗体;同时将经Protein G纯化的单抗用胃蛋白酶酶切获取Fab片段,作为检测原,并采用间接ELISA和间接竞争ELISA对抗独特型抗体特性进行鉴定。结果:所研制的抗独特型抗体能够与ZEN竞争结合ZEN单抗,与ZEN之间存在"内影像"关系。结论:成功研制抗ZEN单抗独特型抗体,可以替代ZEN标准品应用于ELISA检测。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的环七肽模拟表位筛选

利用噬菌体随机环七肽库筛选脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)模拟表位。以DON单抗为靶分子,四轮固相淘选噬菌体随机环七肽库,筛选出阳性噬菌体,并通过ELISA实验检测其特异性。对阳性克隆的DNA进行测序,取序列不同的阳性克隆,分别建立阳性噬菌体与DON标准品的竞争抑制曲线。对30个噬菌体单克隆进行活性测定,结果显示能与DON单抗结合的噬菌体克隆有28株,其中的22株能被DON标准品阻断与DON单抗结合。DNA测序结果显示,21株阳性噬菌体的序列是PFPNHPY,另一株的序列是TPWTQHL。其相应噬菌体与DON毒素标准品的竞争曲线结果显示,8号噬菌体建立的竞争抑制曲线线性范围是0.0292~0.636μg/mL,IC_(50)为0.169μg/mL;4号噬菌体建立的竞争抑制曲线线性范围是0.0124~0.271μg/mL,IC_(50)为0.058μg/mL。在随机环七肽库中筛选到TPWTQHL和PFPNHPY两个DON模拟表位,可替代DON毒素标准品,建立DON的免疫学无毒检测技术。

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。

基于独特型-抗独特型玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA检测方法的建立

目的建立基于独特型．抗独特型玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）间接竞争ELISA检测方法，并进行验证。方法采用ProteinG亲和层析法纯化ZEN的p型抗独特型单抗1D5（Ab213-1D5）腹水；以ZEN单抗Fab片段包被酶标板，Ab2β-1D5为一抗，建立ZEN的竞争ELISA检测方法，绘制标准抑制曲线，根据回归方程计算半数抑制浓度（IC50），并确定检出限（IC10）及线性范围。以ZEN类似物呕吐毒素、伏马毒素、赭曲霉素A代替ZEN作为竞争抗原，用建立的方法进行检测，验证方法的特异性；配制6个浓度的ZEN溶液（20、30、40、50、60和75ng／m1），用建立的方法进行检测，计算试验内及试验间回收率和变异系数（CV），验证方法的准确性和精密性。结果Ab2β-1D5单抗的纯化效果较好，浓度为4mg／ml，效价为1：6×104；ZEN单抗Fab片段的最佳包被浓度为1μg／ml。建立的ZEN竞争EHSA检测方法的线性回归方程为：y=-34．099x＋81．857，R2=0．9944，IC50为8．60ng／ml，IC10为0．58ng／ml，线性范围为0．58-128．03ng／ml；该方法检测ZEN类似物伏马毒素、赭曲霉素A和呕吐毒素的交叉反应率均小于0．01％；检测不同浓度ZEN的试验内平均回收率在98．65％-113．45％之间，试验间平均回收率在82．96％-98．00％之间；试验内cy值在0．48％。6．40％之间，试验间cy值在0．94％-8．27％之间。结论应用ZEN单抗的Fab片段和ZEN的B型抗独特型单抗建立了ZEN的间接竞争ELISA检测方法，该方法特异性较强，准确性和精密性良好，且成本较低，快速简便，易于标准化，适用于样品的大量筛选。