凝血因子Ⅺ基因变异致下消化道出血病因分析

目的:对1例遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症患者行内镜下直肠息肉摘除术后出现下消化道异常出血进行病因分析,探讨FⅪ基因变异与治疗后下消化道出血的关系。方法:家系调查(共3代5人)。检测患者及其家系成员相关凝血指标。提取外周血基因组DNA进行PCR扩增,采用DNA直接测序法分析患者FⅪ基因的全部外显子、侧翼序列、5’和3’端非翻译区序列,及家系成员相应的变异位点区域。用PyMol软件构建基因变异前后蛋白模型。结果:患者因“直肠息肉摘除术后3 d,血便2 d”入院。凝血指标检查显示患者的活化部分凝血活酶时间(APTT)、FⅪ活性(FⅪ:C)和FⅪ抗原(FⅪ:Ag)分别为50.9 s、53%和47.2%;其父亲上述3项指标分别为45.4 s、44%和43.1%。DNA测序发现患者及其父亲的FⅪ基因第8号外显子均存在c.841C>T杂合无义变异(p.Gln281*)。蛋白模型分析显示p.Gln281*变异会产生截短蛋白。结论:该家系FⅪ基因第8号外显子c.841C>T(NM_000128)杂合无义变异与其FⅪ水平减低有关,可能也是该患者行内镜下直肠息肉摘除术后出现下消化道异常出血的主要原因。

SERPINC1基因缺陷导致的AT缺陷症患者易发生静脉血栓事件

目的分析12例抗凝血酶(AT)缺陷症患者的基因突变,探讨SERPINC1基因突变与静脉血栓事件的关系。方法本文研究类型为观察性研究-描述性研究:病例系列。收集2014年4月至2021年4月温州医科大学附属第一医院12例AT缺陷患者临床资料,在患者治疗前,采集血标本。采用发色底物法检测血浆AT活性(AT:A),免疫比浊法检测AT抗原(AT:Ag)含量。采用PCR直接测序法分析先证者SERPINC1基因7个外显子及其侧翼序列,对发现的疑似突变用反向测序予以验证。分析SERPINC1基因突变与患者静脉血栓栓塞症(VTE)的相关性,统计占比。结果12例患者的AT:A在30%~66%,均明显下降,7例患者的AT:Ag同步降低,表现为Ⅰ型AT缺陷,5例患者AT:Ag在参考范围,表现为Ⅱ型AT缺陷。共发现12种SERPINC1基因突变,其中6种杂合突变c.456_458delCTT(p.phe121del)、c.318_319insT(p.Asn75stop)、c.922G>T(p.Gly276Cys)、c.938T>C(p.Met281Thr)、c.1346T>A(p.Leu417Gln)和c.851T>C(p.Met252Thr)为首次发现的突变位点。12例患者均有静脉血栓形成表现,其中3例患者包括2例复合杂合突变患者和1例单杂合突变患者,在没有明显诱因下,青壮年时期即发生深静脉血栓(DVT);其他9例患者合并有其他易栓危险因素,包括高龄、高血压、吸烟、妊娠和制动。结论SERPINC1基因缺陷导致的AT缺陷症患者易发生静脉血栓事件,尤其当同时存在其他易栓因素时。

两个遗传性纤维蛋白原缺陷症家系表型与基因突变分析

目的对两个杂合突变导致遗传性纤维蛋白原缺陷症家系进行表型和基因突变分析,并初步探讨其分子致病机制。方法采用凝固法检测两个先证者及其各自家系成员(3代9人和2代3人)凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原活性(Fg∶C),免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg∶Ag)。DNA直接测序法分析先证者FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列及家系成员相应的突变位点区域。通过凝血酶诱导进行纤维蛋白原聚集试验;用ClustalX-2、1-win软件分析突变位点的保守性;用Mutation Taster、PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和LRT在线生物信息学软件预测突变位点的致病性;用Swiss-pdb Viewer4.0.1分析突变前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果家系1先证者和家系2先证者Fg∶C明显下降(分别为1.28 g/L、0.98 g/L);家系1先证者Fg∶Ag正常(2.20 g/L),家系2先证者Fg∶Ag降低(1.01 g/L)。基因分析发现,家系1先证者的FGB基因第2号外显子存在c.293C>A(p.BβAla98Asp)杂合错义突变;家系2先证者的FGB基因第8号外显子存在c.1418C>G(p.BβSer473*)杂合无义突变。同源性分析表明Ala98和Ser473残基在同源物种间呈不同保守状态;在线生物信息学软件预测显示p.BβAla98Asp和p.BβSer473*突变为致病突变;蛋白模型分析显示,p.BβAla98Asp突变使氨基酸之间的氢键发生改变,p.BβSer473*突变产生了截短蛋白。结论家系1先证者的异常纤维蛋白原血症和家系2先证者的低纤维蛋白原血症可能分别与p.BβAla98Asp杂合错义突变及p.BβSer473*杂合无义突变有关。

两个遗传性蛋白C缺陷症家系的临床特征与基因突变分析

蛋白C是一种由肝细胞合成和分泌的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶原^([1]),是机体重要的生理性抗凝物质之一。蛋白C活化后能通过水解活化凝血因子Ⅴ(FⅤa)和活化凝血因子Ⅷ(FⅧa)来抑制凝血酶的产生。遗传性蛋白C缺陷症是由编码蛋白C的基因(PROC)突变引起的导致常染色体显性遗传疾病,纯合或复合杂合突变导致的严重蛋白C缺陷症极其罕见,发病率约为1/400万^([2]),临床可表现为出生后不久发生的新生儿暴发性紫癜.

错义变异所致遗传性低纤维蛋白原血症家系的遗传学分析

目的回顾性分析2个新的杂合错义变异所致遗传性低纤维蛋白原血症(IFD)家系的表型和基因变异,并探讨其分子发病机制。方法选取2个分别于2021年3月30日和2021年5月27日就诊于温州医科大学附属第一医院的IFD先证者及其家系成员作为研究对象。收集临床资料,并检测先证者及其家系成员的凝血指标,用Sanger测序法分析先证者FGA、FGB及FGG基因的变异位点。利用生物信息学软件分析候选变异位点的保守性并预测变异蛋白的致病性,同时模拟变异前后蛋白质结构及分子间作用力的变化。结果先证者1为18岁男性,血浆纤维蛋白原活性(Fg:C)和血浆纤维蛋白原抗原(Fg:Ag)均明显偏低,分别为0.80 g/L和1.00 g/L。先证者2为43岁男性,其Fg:C和Fg:Ag分别为1.35 g/L和1.30 g/L,均偏低;先证者1的父亲、先证者2的父亲及儿子的Fg:C和Fg:Ag均偏低。测序结果发现先证者1及其父亲FGG基因的第7外显子均存在c.688T>G(p.Phe230Val)杂合错义变异;先证者2及其父亲和儿子FGA基因的第6外显子均存在c.2516A>C(p.Asn839Thr)杂合错义变异。同源性分析表明Phe230和Asn839残基在进化上高度保守。生物信息学软件预测提示p.Phe230Val和p.Asn839Thr变异均为致病性;蛋白模拟模型结果显示p.Asn839Thr变异使氨基酸之间的氢键发生改变,从而影响蛋白空间结构的稳定性。结论p.Phe230Val和p.Asn839Thr杂合错义变异可能是这2个家系发生IFD的原因。

两个遗传性低且异常纤维蛋白原缺陷症家系分析

目的对两个复合杂合突变导致低且异常纤维蛋白原(Fg)缺陷症家系进行表型和基因型分析,并初步探讨其分子致病机制。方法调查两个先证者及家系成员(3代7人和3代10人)。采用凝固法检测凝血酶时间(TT)和Fg活性(Fg:C),免疫比浊法检测Fg抗原(Fg:Ag)。DNA直接测序法分析先证者Fg的FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列及家系成员相应的突变位点区域。通过凝血酶诱导进行Fg聚集试验;用ClustalX-2,1-win软件分析突变位点的保守性;PROVEAN和Mutation Taster在线生物信息学软件预测突变位点的致病性;用Pymol软件分析突变前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果先证者A和先证者B,Fg:C明显下降(分别为0.74和0.78 g/L),Fg:Ag同步降低(分别为0.96和0.94 g/L),两个先证者TT均延长。基因测序分析显示,先证者A和先证者B的FGA第6外显子均存在c.2185G>A(p.AαGlu710Lys)杂合错义突变;另外,先证者A的FGG第7外显子存在c.701G>T(p.γTrp208Leu)杂合错义突变,先证者B的FGG第8外显子存在c.1015A>C(p.γSer313Arg)杂合错义突变。保守性分析结果表明,p.AαGlu710、p.γTrp208和p.γSer313在8个同源物种间高度保守;2个在线生物信息学软件预测p.AαGlu710Lys、p.γTrp208Leu和p.γSer313Arg均为致病突变。蛋白模型分析显示,这些突变改变了分子间的氢键和/或空间结构,影响蛋白结构稳定性。结论两个低且异常纤维蛋白原缺陷症先证者可能与p.AαGlu710Lys和p.γTrp208Leu复合杂合突变及p.AαGlu710Lys和p.γSer313Arg复合杂合突变有关。

1种导致凝血因子Ⅺ蛋白分泌障碍的基因突变及其机制研究

目的对1个遗传性凝血因子Ⅺ(FⅪ)缺陷症家系新发现的基因突变进行分子致病机制研究。方法先证者因"肝内胆管结石"于2021年9月就诊于温州医科大学附属第一医院,患者平素无自发性出血症状。收集该先证者及其家系成员(共3代10人)的临床资料和血液样本,采用一期凝固法检测血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)和FⅪ活性(FⅪ:C),酶联免疫吸附实验(ELISA)检测FⅪ抗原(FⅪ:Ag);采用DNA直接测序法对F11基因进行分析。运用生物信息学软件辅助分析突变对蛋白结构和功能的影响。构建野生型和突变型FⅪ蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞;提取阳性转染细胞内的总RNA,将RNA逆转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测转染细胞内F11基因的mRNA表达水平;采用ELISA法和蛋白免疫印迹实验分别检测转染细胞裂解液及培养上清液中FⅪ:Ag含量和FⅪ蛋白表达量。结果先证者APTT为107.9 s(参考范围29.0~43.0 s),FⅪ:C和FⅪ:Ag明显下降,分别为2%(参考范围84%~122%)和5%(参考范围76%~127%)。基因分析显示先证者F11基因第6号外显子存在c.536C>T(p.Thr161Met)杂合错义突变及第13号外显子存在c.1556G>A(p.Trp501Ter)杂合无义突变。生物信息学分析显示,在5种不同物种组成的矩阵中FⅪ蛋白161位点氨基酸均为苏氨酸(Thr),表明Thr161位点在不同物种同源基因间高度保守,p.Thr161Met杂合突变会影响FⅪ蛋白局部分子间结构稳定性。p.Thr161Met突变对F11基因转录水平没有影响,但突变导致FⅪ:Ag含量和FⅪ蛋白表达量在细胞培养上清液中明显低于野生型表达载体,在细胞裂解液中高于野生型表达载体,即p.Thr161Met突变导致FⅪ蛋白分泌障碍。结论p.Thr161Met杂合错义突变和p.Trp501Ter杂合无义突变与该家系FⅪ水平降低有关。p.Thr161Met杂合错义突变不影响FⅪ蛋白的合成,可能导致分泌障碍。