一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

全程健康教育模式在糖尿病护理管理中的应用效果

目的:探讨全程健康教育模式在糖尿病护理管理中的应用效果。方法:选取进3年来在某院治疗的300例糖尿病患者,随机分为观察组和对照组,每组各150例,两组患者的基础治疗完全相同,观察组患者采取全程健康教育模式,对照组患者采取传统教育模式,对比两组患者的效果。结果:观察组患者的日常自我管理护理能力、血糖控制情况、糖尿病知识掌握情况均优于对照组患者,差异具统计学意义(P<0.05)。结论:糖尿病全程健康教育模式效果明显,可作为制度化、常规化的护理措施,在临床上值得推广应用。

新闻观察

受众本位，就是指大众传播媒介在信息的传播活动中，应以最大限度地维护受众的根本利益为出发点，以满足爱众获取多方面信息的需要为己任，以提高受众的思想素质、政治素质、道德素质和科学文化素质为目标，全心全意为受众服务。而现在娱乐新闻的受众本位，更多的是因为经济时代媒体生存离不开市场，而市场化的主要手段就是招揽受众，取悦受众，于是就有了“冯小刚家庭地址被公开”、“王小丫结婚”、

由新闻自由说开去

新闻自由这个看似很老的一直伴随新闻传播事业的发展而存在的问题。新闻宣传要遵守宣传纪律,新闻宣传纪律的背后是国家利益。要做到坚持新闻宣传纪律的同时,做出党和人民都满意的新闻,一是要用正确的思想观点去选择新闻事实,将党性原则融于日常报道;二是注意从群众容易接受的角度和方式进行引导,把宣传和舆论引导通过新闻报道的贴近性和可读性来实现。

标新立异 奇花异葩——谈韩愈“墓志铭”散文的特色

韩愈的墓志铭按内容大致可分为:为达官贵人所写,为才学兼备者所写,为至爱亲朋所写三个方面。这些墓志铭内容充实,情感真挚,形式活泼多样,并且具有一定的史料价值,从而形成了其墓志铭散文独具的特色。

南宋豪放词派成因初探

词到南宋,面对国破家亡,民族生死存亡之秋,已不再是那种浅斟低唱,轻歌曼舞的作品,而是一种武器.爱国者用它来抒写对国事的忧愤和英雄无用武之地的悲慨,一时期出现了大量的"壮词",词风一般都激昂悲壮、豪迈奔放,从而形成一种豪放风格,形成一个流派.

略论李商隐对杜甫诗风的继承

李商隐作为晚唐的一位有独特艺术成就的杰出诗人 ,无论是体材的选择上 ,还是诗歌的创作上都继承了杜甫诗歌关注国家命运、沉郁顿挫。

畜禽养殖过程中病死动物及粪污无害化处理的问题浅析

通过对临汾市尧都区17个乡镇养殖场病死动物及粪污无害化处理的调研,全面系统阐述了养殖场无害化处理工作的意义和问题分析、无害化处理方法和今后工作建议。

鸡传染性喉气管炎的危害

许多养殖户对鸡传染性喉气管炎的认识不足,常常造成重大的经济损失。本文对鸡传染性喉气管炎做了全面细致的论述,提出了预防方面的合理化建议。

如何加强畜禽的产地检疫

动物的产地检疫作为动物检疫工作的重要内容,在许多地方都没有开展起来。针对产地检疫不能开展的原因,需要我们加强相关认识、健全规章制度、落实法律实施,逐步规范产地检疫。

新城疫病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白单克隆抗体,本研究将编码该蛋白的基因克隆、表达并纯化重组蛋白,作为免疫原免疫小鼠,同时建立ELISA筛选方法对小鼠血清效价进行测定,筛选出血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,最终获得能稳定产生NDV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行了抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定、杂交瘤细胞染色体计数、小鼠腹水制备及腹水内单克隆抗体效价测定。结果显示,PCR、重组质粒测序及双酶切鉴定正确,M基因大小约为1095 bp。SDS-PAGE和Western blotting检测显示,试验成功表达了重组M蛋白,分子质量约为60 ku,且可与NDV阳性血清反应。建立的ELISA筛选方法中,重组M蛋白、His标签蛋白和抗体的最佳工作浓度分别为0.5μg/mL、0.5μg/mL和1∶256000。抗体的免疫荧光、Western blotting、亚类的鉴定显示,杂交瘤细胞产生的抗体可与NDV SG10株及重组M蛋白特异性结合,其轻链为κ,重链为IgG2A。C9-G2、D3-F2杂交瘤细胞染色体计数结果分别为97和101条;杂交瘤细胞上清的ELISA检测效价均为1∶6400,腹水的ELISA检测效价分别为1∶409600和1∶102400。本研究成功制备了NDV M蛋白的单克隆抗体,可为进一步研究M蛋白的功能提供工具。

新形势下基层党建考评工作的问题及优化策略

基层党组织数量众多,随着党建工作的受重视程度不断提高,基层党建考评工作显得至关重要。通过对部分基层党组织的党建考评工作的开展状况进行分析可以发现,基层党建考评工作中存在很多不足之处。受多方面因素的影响,基层党建考评工作中存在很多具体问题。在相关问题客观存在且无法得到有效解决时,基层党建工作的有效性难以得到有效提升。论文分析了新形势下基层党建考评工作开展过程中存在的问题,并就相关问题如何解决提出合理建议。

浅谈小反刍兽疫的防控措施

小反刍兽疫是以感染山羊和绵羊为主的急性、接触性、病毒性传染病,传播速度快,死亡率高,是严重危害养羊业的疫病之一。对此病要采取非特异性预防和疫苗接种相结合的综合措施。

传统媒体与网络媒体在议程设置中的互动

“议程设置功能”作为一种理论假说，最早由美国传播学家M．E．麦库姆斯和D．L．肖提出，即为公众安排议论的话题，决定人们想什么和谈什么。现实中传统媒体和网络媒体议程设置有无联系？是不是从来都是“井水不犯河水”呢？本文试着通过一些现实的案例来分析传统媒体与网络媒体在议程设置中的互动。

探析中国传统元素在室内环境设计中的运用

室内设计在我国有着悠久的发展历史,我国艺术与国际接轨的同时,室内设计正面临着国际竞争的挑战,我国室内设计只有将传承下来的历史文化的精髓与民族元素进行有机结合,巧妙地运用在现代室内设计里,把我国特色的历史与民族结合的艺术体现出来,打造一个具有中国风的艺术风格,才能顺应国际艺术的潮流。对于装饰的元素应以本国为基础,用艺术去体现我国的地域特点与人文关怀。基于此,本文对中国传统元素在室内环境设计中的运用进行了阐述。室内室内设计在我国有着悠久的发展历史我,我,我国艺术与国际接轨的同时,室内设计正面临着国际竞争的挑战,我国室内设计只有将传承下来的历史文史文化的精髓与民族元素进行有机结合,巧妙地运用在现代室内设计里,把我国特色的历史与民族结合的艺术体现出来打,打造一个具有中国风的素在室内环境设计中的运用进行了阐述。