猪瘟E^(rns)基因在大肠杆菌中的高效表达

提取猪瘟病毒石门系强毒株的基因组RNA,用RT_PCR扩增其Erns基因的cDNA,将其克隆到原核表达载体pPROEXTMHTc中,然后转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,Erns基因获得高效表达。SDS_PAGE分析显示,表达的重组融合蛋白表现分子量约为31ku。Westernblot分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性。重组蛋白可用于制备诊断抗原,用于标记疫苗接种和野毒感染的鉴别诊断。

基于重组E^(rns)蛋白的猪瘟E^(rns)-ELISA的建立和优化

将大肠杆菌表达的猪瘟病毒重组Erns蛋白经纯化后作为包被抗原,建立了检测猪瘟抗体的Erns-ELISA方法。经优化试验,确定了最适抗原包被量为0.15μg;血清最适稀释度为1∶100。经阻断试验、交叉反应试验和重复性试验证明,建立的Erns-ELISA简便、特异、稳定,与基于重组E2蛋白的E2-ELISA的符合率高达96.7%,与基于全病毒抗原的Dot-ELISA符合率为77.5%。可以用于猪瘟抗体的血清学监测以及用作基于E2蛋白的标记疫苗配套的鉴别诊断。

基于SemlikiForest病毒RNA复制子的猪瘟RNA疫苗的初步研究

将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。

弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建

为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。

体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响

为探索体外弓形虫感染小鼠巨噬细胞对其极化的影响,本研究采用M-CSF诱导分离的小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞,在体外以弓形虫感染骨髓来源的巨噬细胞,分别于感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞和细胞培养液,利用Griess法和Arginase活性试验对i NOS和Arginase-1的酶活性进行检测。通过荧光定量PCR和western blot方法分别从m RNA水平和蛋白水平测定巨噬细胞中i NOS和Arginase-1的表达量。结果显示,弓形虫感染巨噬细胞后细胞中的Arginase-1的m RNA和蛋白含量均显著上调表达,i NOS的m RNA虽有短暂小幅度上调,但蛋白的含量无明显变化。本研究表明弓形虫感染巨噬细胞后能够明显诱导静息状态的巨噬细胞朝向M2型的方向极化,从而改变巨噬细胞的表型和功能。本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了实验依据。

弓形虫酵母双杂交cDNA文库构建及与AMA1羧基端相互作用蛋白的筛选

为筛选弓形虫AMA1基因羧基端(AMA1c)在弓形虫中的相互作用分子,本研究采用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了弓形虫RH株酵母双杂交cDNA文库,文库滴度达到4.26×107cfu/mL。以构建的pGBKT7-AMA1c诱饵质粒,使用PEG/LiAc法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测AMA1c的自激活作用并进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆,根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中具有无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共得到13个与AMA1c蛋白相互作用的虫体蛋白。本研究结果为进一步研究AMA1c的功能奠定了基础。

新孢子虫cDNAT7噬菌体展示文库的构建及筛选

为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别提取犬新孢子虫免疫小鼠血清和感染小鼠血清中的IgG,并利用纯化的IgG对构建的新孢子虫cDNA文库进行筛选。经过3轮筛选,共鉴定出14个不同的犬新孢子虫基因插入片段。经过分析,有7个基因编码的是功能未知蛋白,其它为蛋白质合成相关蛋白、核苷酸代谢相关蛋白、核糖体蛋白、微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。对这些蛋白的进一步研究将有助于开发新孢子虫病的诊断试剂和疫苗。

小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因的克隆和表达

通过 PCR扩增出小球隐孢子虫 (Cryptosporidium parvum) P1 5基因片段。将该片段连接到克隆质粒载体 p U C1 9的 Bam H 酶切位点上 ,并对其序列进行了测定。结果表明 ,该基因长度为 4 79bp,编码的表面蛋白由 1 4 8个氨基酸残基组成。再将 P1 5蛋白基因片段分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达 ,经 SDS- PAGE分析和 Western blot检测 ,结果表明 ,小球隐孢子虫 P1 5蛋白基因在大肠杆菌内获得表达的融合蛋白相对分子质量为 5 0 0 0 0 ;在哺乳动物细胞中 ,重组痘病毒表达的蛋白相对分子质量为 1 80 0 0～ 2 2 0 0 0 ,与直接从自然感染牛小球隐孢子虫分离的 P1

猪瘟研究近况(下)

(上接2004年12期55页) 2猪瘟疫苗 2.1常规疫苗 猪瘟灭活苗是40～50年代曾经使用过的传统疫苗,当时该苗就表现出质量不稳定,主要是免疫期短和保护力低等.时至今日,组织培养猪瘟病毒的产量和灭活所造成的病毒有效抗原的损失仍是制造灭活疫苗的两大障碍.猪瘟弱毒疫苗的成功问世,改变了猪瘟防制的窘迫局面,三大品系猪瘟疫苗(中国的C-株、日本的CPE(株和法国的Thiverval株)的广泛应用(通常能提供终身免疫)对于控制猪瘟的流行起到了关键作用.

布氏锥虫C型凝集素类似蛋白的鉴定

C型凝集素在机体免疫系统中具有重要的作用。为了解布氏锥虫(T.brucei)基因组编码的C型凝集素类似蛋白(CLLPs),本研究在GeneDB数据库中通过软件鉴定了13种T.brucei基因组编码的CLLPs家族基因序列,并分析它们之间的遗传进化关系。同时,采用RT-PCR方法检测了其中3种CLLPs基因在血液阶段(BSF)T.brucei虫体内的转录。利用PCR扩增并在大肠杆菌中对所选3种基因进行表达,以表达的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。实验结果表明,本研究选择的3种CLLPs基因在BSF T.brucei虫体内均能够进行转录;而通过间接免疫荧光检测表明所选的3种CLLPs基因中,只有一种CLLP(Tb5290)在T.brucei的BSF阶段和昆虫阶段(PCF)表达。本研究首次在T.brucei中鉴定了C型凝集素家族的新成员,为进一步了解CLLPs在T.brucei中的生物学功能的研究奠定了基础。

MDCK细胞中IFN-γ诱导的免疫相关GTP酶在弓形虫PVM表面的定位研究

为探究犬MDCK细胞中γ-干扰素(IFN-γ)诱导的免疫相关的GTP酶在刚地弓形虫(T.gondii)的纳虫空泡膜表面的定位情况,本研究采用慢病毒包装载体将免疫相关的GTP酶(Irgb11)与GFP的融合基因(Irgb11-GFP)引入犬MDCK细胞中,经荧光鉴定和western blot检测到Irgb11-GFP融合蛋白的表达,表明构建了过表达Irgb11的细胞系。采用IFN-γ诱导该细胞系24h后,接种弓形虫PLK株,以间接免疫荧光试验检测,并通过激光共聚焦扫描显微镜观察,结果显示Irgb11-GFP蛋白获得表达并能够与弓形虫PLK株的纳虫空泡膜(PVM)发生共定位,表明在IFN-γ存在的情况下,犬MDCK细胞中的Irgb11可以被募集到弓形虫PVM表面,从而发挥其破坏弓形虫PVM的功能。本实验为进一步研究犬细胞中抑制弓形虫生长的机制奠定基础。

体外弓形虫感染小鼠小胶质细胞及对其极化的影响

为探究体外弓形虫(T.gondii)感染小鼠小胶质细胞(Microglia)后对其极化的影响,将PLK株弓形虫接种原代小胶质细胞,分别在弓形虫感染细胞后6 h、12 h、24 h、36 h以及48 h收集细胞及培养上清,利用荧光定量PCR、western blot分别检测小胶质细胞M1型以及M2型标记分子的表达水平。采用Griess法和精氨酸酶活性试验分别检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1)的酶活性。结果显示,弓形虫感染细胞后M1型标记分子iNOS与IL-6的mRNA转录水平与蛋白水平均显著上调(p<0.001),而M2型标记分子Arginase-1与IL-10无明显变化(p>0.05)。此外,酶活性检测结果显示iNOS在弓形虫感染6 h～48 h与对照组相比其表达水平有显著差异(p<0.001),而Arginase-1在该时间段表达差异并不显著。本研究结果表明,弓形虫感染小胶质细胞后能够明显诱导静息状态的小胶质细胞向M1型极化,从而改变小胶质细胞的表型和生物学功能,本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了依据。

基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系

由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以本实验室构建的含有单链引导RNA(sgRNA)骨架转录序列的通用质粒(p Gen-sgRNA)为模板,将U6启动子与合成的相关基因gRNA靶序列经PCR融合扩增,其产物再与sgRNA的骨架转录序列进行重叠延伸PCR扩增,并将扩增产物克隆于p GEM-T载体中,分别构建了具有靶向不同目的基因ORF的gRNA重组质粒。将这些重组质粒分别与pMJ920质粒共转染于MDCK细胞中,通过G418筛选和流式细胞仪分选,并以终点稀释法纯化培养筛选出的单细胞克隆株。经gRNA靶序列片段的测序鉴定,获得了目的基因敲除的MDCK细胞系,并分别命名为MDCK-IRGM4-、MDCK-IRGM5-和MDCKIRGM6-。通过western blot检测经γ干扰素诱导条件下的这3种IRGMs基因在敲除细胞系中相应的蛋白表达均为阴性。这3种MDCK细胞IRGMs敲除的细胞系的建立,为进一步研究IRGMs基因在抗细胞内病原微生物感染中的功能奠定了基础。

弓形虫Rop46基因敲除虫株的构建及其生长复制能力评价

棒状体蛋白(Rops)是弓形虫的一类与侵入、复制相关的重要分泌蛋白。Rop46蛋白在弓形虫急性感染阶段和慢性感染阶段的表达存在显著差异。为探究Rop46的生物学功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了Rop46基因敲除重组质粒,制备了Rop46基因缺失虫株。序列分析表明,基因缺失虫株中的Rop46基因的编码序列缺失了82个碱基,证明本研究构建的基因敲除重组质粒能够有效的在弓形虫PLK虫株中敲除目的基因。利用流式细胞术对Rop46基因缺失虫株的生长特性进行检测和分析,结果显示Rop46基因缺失虫株的侵入和复制效率显著降低,表明缺失Rop46基因可能对PLK虫株的侵入及复制能力具有显著影响。

免疫蛋白酶体亚基LMP7在弓形虫脑炎中的作用研究

免疫蛋白酶体在炎症性疾病模型中发挥重要作用。为研究免疫蛋白酶体亚基LMP7在弓形虫感染引起小鼠脑部炎症过程中的作用,本研究将36只BALB/c小鼠随机分为3组,每组12只:对照组小鼠腹腔注射PBS,实验组小鼠腹腔注射弓形虫RH强毒株,于人工感染第2 d分别对实验组小鼠腹腔注射PBS(RH+PBS组)和PR-957(RH+PR-957组,免疫蛋白酶体亚基LMP7特异性抑制剂),分别于感染后第10 d和第23 d随机迫杀6只小鼠采集脑组织,western blot结果显示,RH+PR-957组小鼠的免疫蛋白酶体亚基LMP7在感染后第23 d时未见其表达被抑制;该组小鼠LMP10和LMP2表达量与RH+PBS组对比变化不大。小鼠存活率结果显示,RH+PR-957组小鼠存活率为67.7%,高于RH+PBS组和PBS组;脑组织病理学结果显示,RH+PBS组小鼠脑组织内有明显的血管套现象,RH+PR-957组小鼠脑组织有胶质细胞浸润和轻微的血管套现象;免疫组化结果显示,RH+PBS组小鼠脑组织中小胶质细胞的数量相比于RH+PR-957组增多,细胞突起变长、变粗,呈现高分枝状;荧光定量PCR结果显示,RH+PR-957组小鼠脑组织的促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6的RNA转录水平明显低于RH+PBS组。上述结果表明抑制免疫蛋白酶体亚基LMP7的表达可减弱弓形虫感染引起的小鼠脑部炎症。本研究为免疫蛋白酶体亚基LMP7在弓形虫性中枢神经系统疾病致病机理的研究奠定基础。

弓形虫翻译控制肿瘤蛋白促进组胺释放活性的研究

为研究弓形虫感染后产生炎性反应的分子机制,本研究将预测的弓形虫翻译控制肿瘤蛋白(TgTCTP)基因进行原核表达,并且利用竞争性ELISA检测方法鉴定重组TgTCTP蛋白(r TgTCTP)促进小鼠腹腔细胞释放组胺的活性反应。研究结果显示,TgTCTP定位于弓形虫速殖子的胞浆内,以多聚体的形式存在;原核表达的r TgTCTP诱导小鼠腹腔细胞释放组胺的活性(22.225±2.358 ng/m L),显著高于GST蛋白组(10.956±2.819 ng/m L),结果表明表达的r TgTCTP能够促进小鼠腹腔细胞组胺的释放(p<0.01)。本研究为TgTCTP功能进一步的鉴定和弓形虫引起炎症反应的分子机制研究奠定了基础。

弓形虫Rop32与宿主细胞相互作用蛋白的初步筛选

弓形虫棒状体蛋白32(Rop32)是由弓形虫棒状体在感染细胞中分泌于宿主细胞中的磷酸激酶,但其功能尚不清楚。为筛选与Rop32相互作用的宿主蛋白,本研究利用构建的p GBKT7-Rop32诱饵质粒转化酵母菌株Y2H,通过表型从人包皮成纤维细胞文库中筛选与Rop32相互作用的宿主蛋白。结果表明p GBKT7-Rop32诱饵质粒无自激活和细胞毒性作用。通过酵母双杂交,共筛选到12个与Rop32具有相互作用的宿主细胞蛋白。将筛选的阳性克隆进行序列分析结果表明,筛选到的蛋白包括1个参与蛋白转运相关蛋白、1个凋亡相关蛋白、1个细胞骨架蛋白、1个参与能量转化的磷酸转移酶以及8个其它蛋白。利用免疫共沉淀试验进一步验证了Rop32和SEC63蛋白之间的特异性相互作用。Rop32与参与蛋白转运的SEC63的相互作用提示Rop32可能在弓形虫对营养物质和代谢物的运输过程中发挥作用。