牛支原体疫苗研究进展

牛支原体(M.bovis)是牛的重要病原体,能够引起牛的乳腺炎、关节炎和肺炎等疾病。牛支原体已在全世界传播,对全球范围内的养牛业产生了重大不利影响。目前,由于牛支原体的耐药性有增强的趋势,同时缺乏有效的疫苗和治疗方法,这严重阻碍了牛支原体感染的控制。预防、控制甚至清除牛支原体最好的方法是使用有效的疫苗。虽然目前我国还没有获得新兽药证书的牛支原体疫苗,但相关的研究已取得了一定的进展。本文根据多年来牛支原体疫苗研究的相关资料,从牛支原体感染与免疫机制、灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因工程疫苗四个方面进行综述,以期为今后牛支原体疫苗的研制提供思路及参考。

一株猪源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性鉴定及其消除

猪源鼠伤寒沙门氏菌临床分离株17Y,检测其对19种抗生素的耐药性,结果耐14种抗生素。用高温及高浓度SDS处理后,获得对11种抗生素的敏感性,该菌株命名为17S1。PCR检测证明,大部分耐药基因存在于质粒上,包括I型整合子携带耐药基因,且随着质粒的消除而被消除。所鉴定的耐药基因有blaTEM、blaOXA-1、cat1、tet(B)、aacC2、aadA8b、dhfrXⅡ和sul1等。喹诺酮类药物的靶基因gyrA与parC位于染色体上。GyrA在耐药决定区第87位氨基酸突变(N78D),导致了喹诺酮类药物的耐药性逆转。敏感菌中扩增不到质粒毒力基因spv与rck。耐药性消除后的菌株17S1对小鼠的毒力降低(LD50增加10倍),在小鼠体内的增长与散速度也显著降低(P<0.05)。以上证据表明,鼠伤寒沙门氏菌的多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型质粒消除剂将对克服鼠伤寒沙门氏菌多重耐药性具有重要意义。

副猪嗜血杆菌毒力因子的研究现状

副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害我国养猪业发展的新发细菌性传染病,我们对其毒力因子的了解却很少。为了更加全面地认识该病原体,作者对副猪嗜血杆菌各种因素与菌株毒力的关系做了简要的介绍。其中重点介绍了血清型与毒力的关系,较为全面地概述了巴氏杆菌科毒力相关因子荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及酶类与副猪嗜血杆菌毒力的关系,并认为神经氨酸酶是副猪嗜血杆菌重要毒力因子。副猪嗜血杆菌的毒力因子的研究是副猪嗜血杆菌病研究的一个重要方向。

副猪嗜血杆菌毒力因子的研究进展

目前预防和控制革拉斯氏病仍然非常困难,副猪嗜血杆菌是革拉斯氏病的病原菌,定殖于健康猪群的上呼吸道中。了解副猪嗜血杆菌的病原性对于确定其如何引起发病和更好的区分"毒力"和"非毒力"菌株是必要的。副猪嗜血杆菌感染需要粘附和入侵宿主细胞,抵抗巨噬细胞的吞噬,抵抗补体结合并诱发炎症反应。鉴定这些机制过程中的毒力因子在方法上受到一定的限制。关于副猪嗜血杆菌的发病机制的最新进展集中在突变株的构建,然而目前大多数的所谓的毒力因子需要进一步鉴定。

应用多重PCR检测屠宰猪扁桃体中的猪链球菌

从广东省部分地区肉联厂采集屠宰猪扁桃体401份,用两个多重PCR检测样品中猪链球菌(SS)及其主要致病血清型。检出SS阳性样品154份(38.4%),其中69份(17.2%)携带SS2,35份(8.7%)携带SS9,而SS7和SS1分别为9份(2.2%)和3份(0.7%)。不同血清型SS菌株可混合感染同一头猪,但比例均小于5%。在地区分布上,粤西地区SS阳性率(18.3%)明显低于其他地区(p<0.01),其余各地区之间均无显著差异(p>0.05),在35%～70%之间。对全部样品进行细菌分离,共分离到SS53株,分离率为13.21%;其中SS225株(6.23%),SS93株(0.75%),SS71株(0.25%),未定型SS24株(5.99%),细菌分离的阳性率远比PCR检测结果要低。此检测结果证实了华南地区猪群中广泛存在SS,并呈多个血清型混合感染,而且流行呈地域性的特点,凸显了SS流行的复杂性。

抗原表位研究方法进展

抗原表位是抗原分子中的主要功能单位,能有效刺激机体的细胞免疫和体液免疫。随着免疫学和生物信息学技术的不断发展,用于研究T细胞表位和B细胞表位的方法得到了很大的提高。论文中概述了近几年用于研究T细胞表位的预测方法和鉴定方法,以及在B细胞表位研究中所用的表位肽扫描技术、蛋白质"切割"法、噬菌体展示技术、X-衍射与核磁共振、表位预测方法等技术,并对每种研究方法进行了比较,为从事抗原表位研究的人员提供参考,从而更有利于表位肽疫苗的研制和诊断方法的建立。

猪链球菌扁桃体分离株的毒力因子分布特征与致病性

本研究设计并合成7对引物,用PCR方法对猪链球菌7种主要毒力因子,包括谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶血素(sly)、胞外蛋白因子(ef)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、三磷酸甘油醛脱氢酶(gadph)和毒力相关序列orf2进行检测,分析了29株猪链球菌扁桃体分离株的毒力因子分布特征。在被检的25株2型菌株中,共检测出7个基因型。其中10株(40%)的基因型为cps2/gdh+/sly+/ef+/mrp+/fbps+/gadph+/orf2+,7株(28%)表现为cps2/gdh+/sly-/ef-/mrp+/fbps+/gadph+/orf2+,4株(16%)表现为cps2/gdh+/sly-/ef+/mrp+/fbps+/gadph+/orf2+,基因型表现为cps2/gdh+/sly+/ef+/mrp+/fbps+/gadph+/orf2-、cps2/gdh+/sly-/ef-/mrp+/fbps+/gadph+/orf2-、cps2/gdh+/sly-/ef-/mrp*/fbps+/gadph+/orf2+、cps2/gdh+/sly-/ef-/mrp-/fbps-/gadph+/orf2-各1株;1株猪链球菌7型(SS7)分离株,基因型表现为cps7/gdh+/sly+/ef-/mrp-/fbps+/gadph+/orf2+;3株猪链球菌9型(SS9)扁桃体分离株,均表现为cps9/gdh+/sly-/ef-/mrp-/fbps+/gadph+/orf2+。可见我国SS分离株的毒力基因分布较为复杂,而且SS2的优势流行菌株是同时具有多种毒力因子的高致病菌株。通过对不同毒力基因型毒株对西藏小型猪的感染试验发现:毒力基因型为cps2/gdh+/sly-/ef+/mrp+/fbps+/gadph+/orf2+的健康扁桃体分离株SH06-21D对西藏小型猪有较强的致病性,仅次于标准株HA9801,而基因型为sly-/ef-/mrp-/fbps-/gadph+/orf2-的健康扁桃体分离株GZ06-122B对西藏小型猪不表现明显的致病性。

致病性猪沙门菌四环素耐药基因tetB的PCR检测

目的检测临床分离猪源致病性沙门菌四环素的耐药基因,确定沙门菌四环素耐药基因类型。方法用KB法测定分离株对四环素等21种抗生素的耐药情况,用PCR方法检测四环素耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG及tetK,并对扩增产物进行测序。结果临床分离株全部对四环素耐药,33株沙门菌中有29株扩增出tetB特异性片段,基因序列与参考菌的同源性为99%,tetB检测与药敏试验阳性符合率为87.9%。结论tetB的PCR检测对四环素耐药性具有较高的特异性,tetB基因是决定本试验中临床分离株四环素耐药的主要基因,为四环素耐药性的分子流行病学监测提供了依据。

绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd^-缺失株平衡致死载体系统中的表达

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株,毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性,构建了以C500为亲本菌,用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转移的方法构建了无抗性标记的asd-缺失株。首先构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失1408bp的带有蔗糖敏感基因sacB的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的asd-缺失株,通过PCR鉴定。该缺失株在无外源DAP(二氨基庚二酸)条件下溶菌死亡,它的生长必需外源DAP。PCR扩增绿荧光蛋白突变体4基因,克隆到带有asd基因的原核表达载体pYA3493中,电转化C500asd-缺失株,转化子在LB中生长,并激发强的绿荧光。上述结果表明,该asd-缺失株的构建是成功的,并且可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为开发C500为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

鼠伤寒沙门菌外膜蛋白与耐药性关系的分析

目的分析鼠伤寒沙门菌外膜蛋白(OMP)与耐药性的关系。方法用消除剂丫啶橙消除耐药性,盲传测其遗传稳定性,采用超声波物理裂解法制备鼠伤寒沙门菌外膜蛋白标本,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)检测外膜蛋白,用紫外分光光度计测其吸光值,计算浓度。结果抗性消除表型能稳定遗传,耐药鼠伤寒沙门菌与敏感鼠伤寒沙门菌都含有6条主要的外膜蛋白条带,两者相比,发现耐药菌的外膜蛋白在约57、53、30 kDa处减弱或缺失,总的蛋白浓度也低于后者。结论鼠伤寒沙门菌耐药性与外膜蛋白的减弱或缺失有关。

广东地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定

采用细菌分离的方法,结合PCR检测,生化鉴定,对广东地区2007年9月-2008年9月37个患病猪场送检的372份病料进行副猪嗜血杆菌分离鉴定,通过数据统计分析,显示副猪嗜血杆菌分离率达24.00%,副猪嗜血杆菌感染猪场阳性率达40.54%,表明副猪嗜血杆菌病在广东地区已普遍流行。

白花蛇舌草提取物对肉鸡淋巴细胞增殖功能的影响

为了研究中药白花蛇舌草对肉鸡免疫力的调节作用,探讨其作用机理。在体外培养的肉鸡血液和脾脏淋巴细胞中加入不同浓度的白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮等成分,观测其对淋巴细胞增殖功能的影响。白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮分别在浓度为4 000 mg/L、1 000 mg/L^2 000 mg/L和5 mg/L^100 mg/L时对鸡血液淋巴细胞有明显的刺激增殖作用(P<0.05),在浓度为200 mg/L^800 mg/L、10 mg/L^1 600 mg/L和25 mg/L^50 mg/L时对鸡脾脏淋巴细胞的增殖具有明显的刺激作用(P<0.05)。研究结果说明白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮对体外培养的肉鸡淋巴细胞的增殖均有促进作用。

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌的快速分离鉴定

猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原菌,给养猪业造成重大危害。本文旨在建立一套细菌快速分离鉴定方法,为该病流行病学调查提供有效手段。从临床初诊为仔猪副伤寒的病猪采集粪便,接种亚硒酸盐亮绿增菌液增菌后,划线于SS琼脂培养基,挑无色透明菌落纯化。纯化菌落用美国B IOLOG自动细菌鉴定仪GN2肠杆菌鉴定板鉴定,同时用常规生化鉴定管鉴定,结果符合猪霍乱沙门氏菌的生化特征。PCR扩增invA基因,测序鉴定PCR产物,结果与猪霍乱沙门氏菌参考序列同源性达99%以上。分离菌株接种小白鼠,证明其对小白鼠有致病性。用沙门氏菌属标准血清检测证实其抗原式为6,7∶c∶1,5,符合猪霍乱沙门氏菌的抗原特征。应用以上方法从全国各地病料中分离鉴定了40多株猪霍乱沙门氏菌,为猪霍乱沙门氏菌病的流行病学调查提供了依据,同时证明该方法切实可行。

水土保持补偿费、赔偿费和水土流失防治费的概念及内涵

随着水土保持监督执法工作的深入开展,依法查处的水土保持违法案件越来越多,其涉及的范围及类型也越来越广,水土保持法赋予水土保持部门的审批、收费、监督“三权”正逐步得到落实.在具体执法活动中,依法征收水土保持相关费用既是执法的主要内容之一,也是保证水土保持法规贯彻实施的一种经济制约手段.但是。

抗杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示,ELISA检测方法最佳条件为抗原包被浓度0.5×105.8TCID_(50)/0.1 mL,37℃包被2 h,37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25600,平台期可持续40~60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状病毒生物制品的潜力,杂交鳢弹状病毒卵黄抗体的制备及快速检测方法的构建为该病的防治提供了理论基础和技术手段。

猪链球菌9型菌株的分离鉴定

为了确诊四川省某猪场1头25日龄左右的后腿跛行并急性死亡仔猪的病因,并制定对猪群其他猪只的预防和治疗方案。本试验剖检死亡仔猪,取脾脏、肝脏、肺脏组织和血液进行细菌分离培养,革兰染色镜检,PCR分型鉴定和药敏试验。结果显示,分离培养的细菌革兰染色为阳性;分离菌株经PCR检测为猪链球菌9型;药敏试验确定该分离菌株对氨苄西林、环丙沙星、氟苯尼考、青霉素、多西环素、头孢氨苄、氧氟沙星、头孢拉定、头孢呋辛和氯霉素敏感。结果表明,该猪场仔猪为感染猪链球菌9型引起的急性死亡,通过头孢类等药物可以有效的治疗发病仔猪。