日本血吸虫四跨膜孤儿受体(TOR)克隆及其第一个膜外区基因的表达

埃及血吸虫和曼氏血吸虫四跨膜孤儿受体(trispanning orphan receptors,TOR)受体可以结合补体C2a,可能在血吸虫免疫逃避过程中起重要作用。为研究日本血吸虫TOR受体的特性和功能,利用PCR扩增到Sj TOR基因并进行了生物信息学分析;同时克隆了Sj TOR基因N端第一个膜外区(ed1)基因,构建了重组质粒p ET-28a-Sj TOR-ed1,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达后用组蛋白亲和层析纯化获得重组蛋白Sj TOR-ed1,Western blot结果显示r Sj TOR-ed1能被日本血吸虫阳性小鼠血清识别。该研究为进一步开展研究日本血吸虫TOR受体的功能提供了基础。

日本血吸虫C1q结合蛋白基因的克隆表达及其免疫保护效果评估

本研究利用PCR技术扩增到日本血吸虫C1q BP基因,构建了重组表达质粒p ET-32a(+)-Sj C1q BP,并在大肠杆菌中进行表达。将重组蛋白免疫小鼠评估其免疫保护效果,采用Western blot检测其免疫原性,ELISA检测其特异性抗体水平,应用补体溶血试验分析重组蛋白对补体溶血的抑制效果。结果显示日本血吸虫C1q BP基因含729 bp的编码序列,在大肠杆菌中BL21(DE3)中表达后,用His-Bind亲和层析纯化可获得50 k Da的重组蛋白r Sj C1q BP。应用重组蛋白r Sj C1q BP免疫BALB/c小鼠可产生较高水平的特异性Ig G抗体,诱导36.08%的减虫率和43.45%的肝脏减卵率;补体溶血试验结果表明该重组蛋白能够抑制补体溶血。本研究结果为进一步研究日本血吸虫Sj C1q BP的生物学功能奠定了基础。

大、小鼠来源32d日本血吸虫凋亡相关基因表达分析

大鼠为日本血吸虫的非适宜宿主,而小鼠为日本血吸虫的适宜宿主。前期研究表明细胞凋亡影响了日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育,然而血吸虫中存在哪些凋亡相关基因及凋亡通路?哪些凋亡相关基因可能影响血吸虫的生长发育相关文献报道较少。本研究构建了日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库,利用人的凋亡基因为索引搜索到了15个日本血吸虫凋亡相关基因。同时收集了大、小鼠来源32 d日本血吸虫,利用荧光定量PCR分析了32 d虫体中凋亡相关基因的表达情况,鉴定了大鼠和小鼠两种不同适宜性宿主来源32 d日本血吸虫差异表达的凋亡相关分子,为探讨日本血吸虫与不同适宜性宿主的相互作用机制提供了基础。

日本血吸虫TOR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

本研究扩增到日本血吸虫Sj TOR完整的蛋白编码区并将其克隆到p XJ40-FLAG载体的HindⅢ、XhoⅠ酶切位点,构建真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR。将测序正确的质粒转染到293T细胞中进行表达,然后应用间接免疫荧光、实时荧光定量PCR、Western blot检测其在293T细胞中的表达情况。测序结果表明Sj TOR蛋白编码区为1245 bp,真核表达质粒p XJ40-FLAG-TOR构建成功。转染293T细胞48 h后,应用间接免疫荧光染色可观察到转染重组质粒的细胞有特异性绿色荧光,空质粒对照则未见。实时荧光定量PCR结果显示,在转染质粒p XJ40-FLAG-TOR 6 h后Sj TOR蛋白的基因已有转录,至转染24 h时转录水平最高,随后开始降低。Western blot结果显示Sj TOR蛋白分子量约53 k Da,可被FLAG单抗和抗Sj TOR-ED1抗血清识别。结果表明Sj TOR蛋白可以在293 T细胞中表达,为进一步研究Sj TOR蛋白的生物学功能和DNA疫苗打下了基础。

7.63m焦炉硅砖检验标准的探讨

太钢7．63m焦炉原设计硅砖检验标准为德国DIN标准。在实际焦炉硅砖检验中我们将国标和德国DIN标准进行了结合，文中就德国DIN标准与国标之间的差别以及在7．63m焦炉耐材检验中的应用情况进行了讨论。

重组抗原rSjPGM和rSjRAD23用于检测山羊日本血吸虫病的初步研究

以日本血吸虫基因重组抗原SjPGM(rSjPGM)和SjRAD23(rSjRAD23)作为诊断抗原,以日本血吸虫虫卵抗原(SEA)作为对照抗原,应用间接ELISA方法对91份日本血吸虫感染山羊血清、44份健康山羊血清、12份捻转血矛线虫感染山羊血清进行了检测。结果显示,rSjPGM和rSjRAD23的敏感性分别为81.3%和66.0%,特异性均为100%,和捻转血矛线虫病血清均无交叉反应;把两种抗原等量混合后检测的敏感性提高到91.2%,特异性下降至95.5%,和捻转血矛线虫感染山羊血清无交叉反应;以SEA作为诊断抗原的敏感性为100%、但特异性仅为75.0%,并且和山羊捻转血矛线虫病血清有25.0%的交叉反应。结果表明,rSjPGM和rSjRAD23混合抗原可作为诊断抗原,用于山羊血吸虫病诊断。

日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达及其功能分析

为深入研究日本血吸虫细胞凋亡机制。利用PCR技术扩增得到Sjcaspase3的全长序列,其ORF含900 bp,编码299个氨基酸,理论分子量为33 509.7 Da,理论等电点为6.39。Real-time PCR分析表明该基因在日本血吸虫生长发育的各个时期均有表达,其中21 d表达量最高,42 d雌虫表达量高于42 d雄虫。成功构建了p XJ40-FLAG-Sjcaspase3重组质粒并转染到Hela细胞内,荧光定量PCR和Western blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela细胞中表达。酶活分析提示重组Sjcaspase3具有切割特异性底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)的活性。流式细胞术检测了Sjcaspase3可诱导Hela细胞发生早期细胞凋亡。研究结果为深入探讨Sjcaspase3的生物学功能及日本血吸虫细胞凋亡机制奠定了基础。