木薯MePPD3基因的克隆及功能分析

为了探究PsbP蛋白是否在木薯(Manihot esculenta)抗病中发挥功能,以木薯‘华南8号’总RNA为模板,通过RT-PCR扩增MePPD3基因(Phytozome数据库编号:Manes.05G127800)。序列分析结果显示,MePPD3基因全长807 bp,编码268个氨基酸,在氨基酸序列第106~266位存在PsbP结构域,推测其为psbP蛋白。蛋白多序列比对、进化树和保守结构域分析表明,木薯MePPD3蛋白与巴西橡胶(Hevea brasiliensis)中PsbP家族蛋白的同源性最高,同源率高达99%。亚细胞定位显示,MePPD3蛋白定位在叶绿体。qRT-PCR结果显示,MePPD3基因在木薯不同组织中的表达量具有较大差异,在叶片特别是成熟叶片中表达量最高;此外,该基因表达量受到菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas phaseoli pv.manihotis,Xpm)诱导后显著上升。利用VIGS技术沉默MePPD3基因,qRT-PCR结果表明,MePPD3基因沉默成功,其表达量显著下降;Xpm侵染植株后,沉默植株pCsCMV-MePPD3叶片的病斑面积显著小于野生型植株,故推测MePPD3可能负调控木薯对细菌性枯萎病的抗病性。

Xpm Ⅲ型效应蛋白XopAG的生物信息学分析及功能验证

木薯细菌性枯萎病(cassava bacterial blight, CBB)是由菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, Xpm)引起的细菌性病害。XopAG是Xpm分泌的一类Ⅲ型效应蛋白,其生化功能和致病分子机制尚不明确。XopAG基因全长1 305 bp,编码434个氨基酸。经在线网站预测,XopAG蛋白有48个磷酸化位点,没有信号肽,不存在跨膜结构域,蛋白二级结构由43.32%的α-螺旋、9.91%的延伸链、5.07%的β-折叠和41.71%的无规则卷曲组成。同源序列比对显示,不同细菌属的XopAG蛋白同源性较低,黄单胞菌属中不同致病变种XopAG蛋白相似性较高。保守结构域分析表明,不同病原菌的XopAG蛋白序列中均含有高度保守的cyclophilin-binding基序(GPxL),该基序能结合亲免蛋白CYP,使寄主植物产生抗性。进化树分析表明,黄单胞菌中不同致病变种的XopAG蛋白亲缘关系相对比较接近,Xpm CHN11编码的XopAG与褐色黄单胞菌莱檬亚种(Xanthomonas fuscans ssp. aurantifolii group C, Xfa-C)亲缘关系最近。采用农杆菌沾花法获得转XopAG基因拟南芥,接种丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000, Pst DC3000),发现转XopAG基因拟南芥对Pst DC3000的感病性增强,说明效应蛋白XopAG具有毒性功能。本研究为进一步研究Ⅲ型效应蛋白XopAG的致病机理奠定了基础。