利用CRISPR/Cas9技术创建拟南芥AtDGK5基因的缺失表达突变体研究

为探究拟南芥AtDGK5基因的功能,本研究构建了CRISPR/Cas9系统靶标AtDGK5基因保守序列的重组质粒,利用农杆菌介导的花序浸染法分别转化野生型拟南芥和T-DNA插入AtDGKs基因的atdgk347三突变体中,并通过PCR、酶切和测序鉴定,获得3株不同位点编辑的atdgk5单突和1株atdgk3457四重突变体。表型检测显示,atdgk5的生长与野生型无明显差异(P>0.05),但其种子在干旱或盐胁迫下萌发与野生型拟南芥有显著差异(P<0.05),并且对ABA胁迫不敏感,暗示AtDGK5对于拟南芥在应答干旱和盐胁迫时发挥重要作用;而atdgk3457四重突变体的幼苗生长受到显著抑制,表明AtDGKs家族的基因参与了植物的生长发育过程,且不同成员间可能功能互补。上述试验结果为深入研究AtDGKs家族基因的功能提供了材料和基础。

拟南芥AtDGK7基因的组织定位及应答不同胁迫的表达分析

二酰甘油激酶(DGKs)是植物肌醇磷脂信号系统中的关键酶之一,催化二酰甘油(DAG)的磷酸化形成植物中新型的第二信使分子磷脂酸(PA)。拟南芥中AtDGKs有7个亚型。本文利用报告基因GUS和实时定量RT-PCR的方法,检测了拟南芥中AtDGK7亚型基因不同组织的表达特征,以及AtDGK7基因在植物受到各种非生物胁迫及激素刺激下的表达变化。结果显示,AtDGK7在幼苗、根以及花器官中均有表达;该基因在盐和干旱胁迫下表达升高,受到24-eBL的诱导表达,暗示AtDGK7对于拟南芥适应逆境发挥重要作用,同时介导了植物对激素的响应过程。我们的数据为进一步研究AtDGK7的生物学功能提供了基础。

中国春小麦肌醇磷脂依赖的磷脂酶C基因的全基因组鉴定及表达分析

【目的】探知小麦基因组序列中肌醇磷脂依赖的磷脂酶C(PLC)的编码基因,解析小麦中PLC基因的结构与进化特征,揭示Ta PLC基因在小麦各组织中的表达模式及其响应盐胁迫和干旱胁迫过程中的表达规律,以便深入分析小麦Ta PLC基因调节小麦应答盐或干旱胁迫中的生理作用。【方法】基于Ensembl Plants全基因组数据库,以水稻和拟南芥PLC基因为参考序列,检索小麦Ta PLC基因家族(http://plants.ensembl.org/index.html),并利用在线蛋白结构分析工具(Pfam、CDD和SMART)对TaPLC基因进行结构分析和鉴定;运用ExPASy(http://cn.expasy.org/tools)分析Ta PLC基因的分子和生化特征;使用Wo LF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)预测Ta PLC基因的亚细胞定位;运用MEGA 7.0软件进行系统进化树分析;并利用实时荧光定量PCR分析Ta PLC基因在不同组织以及幼苗期在盐或干旱胁迫下的表达特征。【结果】在小麦基因组中鉴定了11个Ta PLC基因序列,其编码蛋白与其他植物PLC结构相似,均具有X和Y保守催化结构域以及C2结构域;系统进化分析表明11个Ta PLC基因可分为4组,即Ta PLC1A/Ta PLC1D、Ta PLC2A/Ta PLC2B/Ta PLC2D、Ta PLC3A/Ta PLC3B/Ta PLC3D、Ta PLC4A/Ta PLC4B/Ta PLC4D,均为植物PLC基因家族的直系同源基因,在进化方面具有保守性,但也存在一定的分歧;通过与小麦祖先种比对分析,发现B亚基因组中的Ta PLC1在异源六倍体形成前就已经缺失,进一步表明小麦亚基因组间进化的不对称性;亚细胞定位预测Ta PLC基因定位于叶绿体、线粒体或细胞质中;Ta PLC基因家族各成员的启动子普遍存在植物激素响应和应激响应相关的顺式调控元件;实时定量结果表明,不同的Ta PLC基因在不同的组织中有不同的表达水平,其主要在根、叶、穗和籽粒中表达;且多数基因参与小麦对盐和干旱胁迫的响应,无论是在耐旱和耐盐品种中,还是在对照品种中,Ta PLC基因均受到胁迫的诱导表达,并在12 h内迅速达到峰值。【结论】在小麦基因组中共鉴定11个Ta PLC基因,编码典型的植物PLC蛋白,在进化上具有保守性,但亚基因组间也存在进化的不对称性。不同的Ta PLC基因有各自的组织和细胞表达特征,在小麦生长发育过程中起调节作用;Ta PLC基因在应答盐或干旱胁迫中起重要作用。

植物PLC-DGK/PA途径介导的渗透胁迫应答反应

肌醇磷脂依赖的磷脂酶C(PLC)是经典肌醇磷脂信号系统的重要组分,它分解二磷酸磷脂酰肌醇分子(PIP2)产生双信使IP3和DAG分子。动物细胞中DAG激活蛋白激酶C(PKC)参与调节多种细胞功能。植物基因组中缺乏PKC的同源序列,DAG被二酰甘油激酶(DGK)进一步磷酸化形成磷脂酸(PA),形成新的植物特有的第二信使分子。酶蛋白PLC和DGK及其作用的底物和产物形成植物特色的信号途径,该信号途径在植物对非生物和生物胁迫的反应中发挥重要作用。该文从蛋白信号分子的表达特征和脂质信号分子的含量变化等两个方面综述了植物特色的肌醇信号途径PLC-DGK/PA在应答渗透胁迫反应中的作用。除了PLC-DG活性外,PA也可由磷脂酶D(PLD)产生。该文还对两种途径产生的PA进行了讨论。