人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

人蛋白CcDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白CcDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性 ,针对人蛋白CcDNA序列设计引物 ,运用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白CcDNA ,将其克隆入 pIRESneo载体中 ,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明 ,获得大小为 1386bp的人蛋白CcDNA基因 ,成功构建人蛋白CcDNA载体 pIRES/hPC ,为进一步进行人蛋白CcDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。

重组人蛋白C在HEK293细胞中的表达与鉴定

目的获得转染人蛋白CcDNA的工程细胞株,实现重组蛋白C的表达。方法将构建好的重组表达载体pIRES-hPC用脂质体介导的方法转染HEK293细胞,经G418加压筛选、细胞有限稀释法等获得克隆细胞株,收集无血清培养上清,浓缩后进行鉴定。结果经G418筛选得到了21株克隆化细胞,SDS-PAGE和Westernblot鉴定表明,表达产物含有人蛋白C,且具有抗凝活性。结论在哺乳动物细胞中已成功表达重组人蛋白C,为进一步深入研究及产业化奠定了基础。

猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的 建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法 将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果 经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论 本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;

G418抗性HEK293细胞的培育

目的 培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法 通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果 经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论 成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。

猪内源性反转录病毒在中国实验小型猪中的存在与表达

目的 对中国实验小型猪中内源性反转录病毒的存在与mRNA的表达进行检测 ,摸清中国实验小型猪中内源性反转录病毒的携带情况。方法 根据已发表的PERV的序列设计并合成了三对引物 ,分别用于检测PERV核心蛋白基因 (gag)、多聚酶基因 (pol)及囊膜基因 (env)的存在与表达 ;同时 ,根据目前通用的env基因分型方法合成了三对用于分型检测的引物env A、env B、env C。应用PCR、RT PCR扩增的方法 ,对来自于中国实验小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行了检测。结果 在 6个被检DNA样品中均检出了PERV特异性DNA的存在 ;同样 ,在被检RNA样品中均有PERV特异性RNA的表达 ,且所表达的PERV均为A型和B型 ,在所有样品中均未检出C型PERV的表达。结论 初步表明中国实验小型猪中存在内源性反转录病毒序列 ,且能以mRNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。

人内皮抑素基因的克隆与序列分析

目的 :克隆与鉴定人内皮抑素基因功能区片段。方法 :采用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法 ,从人胎肝总RNA中扩增人内皮抑素基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,命名为pT hES ,并应用A377自动序列分析仪进行序列分析。结果 :成功克隆了人内皮抑素基因 ,经序列分析表明 ,所克隆的基因序列正确。这为利用基因工程技术生产重组蛋白奠定了基础。

人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。

人蛋白C突变体转基因小鼠的建立及乳腺表达

蛋白C（PC）是体内重要的抗凝物质，对静脉血栓扩大、动脉血栓形成、脓毒血症、内毒素血症和弥散性血管内凝血等均具有预防和治疗作用。近年来研究发现蛋白C还具有抗炎作用。血栓疾病及其并发症严重威胁着人类的健康，每年约有1300万人死于血栓疾病及其并发症。脓毒症的死亡率高达30—50％，全球每天有1400人死于严重脓毒症，每年其治疗费用多达76亿美元。所以，进行PC的研究不仅具有重要的医学意义，还具有广阔的市场前景：目前，治疗用PC多为血浆中提取的浓缩剂，人血浆的PC含量较低（3～5mg／L），从血浆中提取PC数量有限，且PC浓缩剂仍存在病毒污染的可能性。因此，利用生物反应器生产重组人蛋白C（rhPC）成为人们关注的热点。