非洲输入性恶性疟病例裂殖子表面蛋白1等位基因型检测

目的了解输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)等位基因型特征。方法采集非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,采用巢式PCR方法,用恶性疟原虫MSP1基因特异引物扩增疟原虫虫株MSP1基因第2区与第3区部分片段,并对MSP1等位基因型进行分析。结果 135例输入性恶性疟患者中检出MSP1等位基因117例,检出率为86.7%。117例扩增阳性的患者中,MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33和MAD20+K1+RO33型的检出率分别为6.0%(7/117)、36.8%(43/117)、20.5%(24/117)、6.8%(8/117)、3.4%(4/117)、17.1%(20/117)和9.4%(11/117),其中混合型感染占36.8%(43/135),MSP1等位基因多重感染平均数(MOI)为1.46。MAD20型、K1型和RO33型恶性疟患者中重症患者比例差异无统计学意义(P>0.05);74例单一型和43例混合型感染者中重症患者比例分别为25.7%(19/74)和32.6%(14/43),2种感染者回国前在国外停留的平均天数分别为(241±176)d和(285±216)d,两者间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论非洲输入性恶性疟患者感染的疟原虫MSP1基因的3种基因型和4种混合型均存在,以K1型和RO33型为优势基因型。

PCR-RFLP检测疟原虫方法的建立和应用效果

目的建立PCR-RFLP方法检测疟原虫,并评价其应用效果。方法收集2010-2018年武汉市输入性疟疾患者血样。根据4种人疟原虫线粒体细胞色素b(Cytb)基因属、种特异位点,设计1组疟原虫属特异性公共引物。提取患者血样中的疟原虫DNA,巢式PCR扩增得到产物后,用限制性内切酶AluⅠ进行酶切,不同种疟原虫将产生特异性的酶切条带,建立PCR-RFLP检测方法。分析该方法的灵敏度和特异度,并与巢式PCR相比较,评价其应用价值。结果PCR-RFLP检测恶性疟、三日疟、间日疟和卵形疟血样(包括curtisi亚种和wallikeri亚种),最低检出阈值分别为2.5、2、3.6、4、1.5个虫/μL血。共检测121份疟疾血样和45份健康人血样,巢式PCR检出阳性115份,PCR-RFLP方法检出阳性118份,灵敏度分别为95.0%和97.5%,结果一致性较好(Kappa值=0.93),差异无统计学意义(χ2=0.8,P>0.05)。PCR-RFLP分别检测日本血吸虫、利氏曼原虫、隐孢子虫样品无任何扩增条带产生,均为阴性。结论建立的PCR-RFLP方法实验流程相对简单,且检出阈值低,敏感度、特异度高,检测结果易于判断,是一种新的疟原虫核酸检测方法。

两种检测方法在间日疟和卵形疟诊断中的应用分析

目的分析疟原虫镜检和巢式PCR检测间日疟和卵形疟效果。方法收集2012～2016年输入性间日疟和卵形疟病例血样,巢式PCR检测疟原虫ssRNA基因,并与显微镜检结果进行比对。结果显微镜检和巢式PCR检测71份血样,间日疟、卵形疟、混合感染分别占74.6%、25.4%、0%和63.4%、29.6%、7%,符合率为81.7%;亚洲23份血样,镜检与巢式PCR均为间日疟,符合率为100%,巢式PCR检测非洲血样48份,间日疟、卵形疟和混合感染分别占45.8%、43.8%和10.4%,镜检与巢式PCR符合率为72.9%;巢式PCR检测26份卵形疟,经典curtisi、变种wallikeri和混合感染分别占80.8%、11.5%和7.7%,检出变种wallikeri总数占卵形疟19.2%。结论巢式PCR检测疟原虫虫种鉴别优于传统镜检法,可提高疟疾病例诊断水平。

卫氏并殖吸虫环介导等温扩增检测方法的建立

2022年于卫氏并殖吸虫流行区湖北兴山县和保康县分别采集34只和27只溪蟹,捣碎后用NaOH消化法提取DNA。根据卫氏并殖吸虫5.8S核糖体RNA序列,使用Primer Explorer V5软件设计卫氏并殖吸虫环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立卫氏并殖吸虫LAMP检测方法,评价该方法的特异性、灵敏度、扩增效率及现场应用效果,并与沉淀镜检法比较。结果显示,建立的LAMP检出限可达1个卫氏并殖吸虫囊蚴,且与日本血吸虫、华支睾吸虫、肝片形吸虫、肝毛细线虫、钩虫等虫种无交叉反应。检测4份卫氏并殖吸虫囊蚴DNA样品,出现浊度时间(Tt值)和浊度速率峰值(Df)均值为29.0 min和0.237。LAMP检出兴山和保康县卫氏并殖吸虫阳性溪蟹分别为24只和0只,阳性率分别为70.6%(24/34)和0(0/27);沉淀镜检法检出囊蚴阳性溪蟹分别为23只和0只,阳性率分别为67.6%(23/34)和0(0/27),两种方法结果差异无统计学意义(χ^(2)=0.2,P>0.05)。建立的卫氏并殖吸虫LAMP检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可用于淡水蟹卫氏并殖吸虫流行区现场调查或筛查。

利什曼原虫环介导等温扩增检测方法的建立及应用

建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)检测利什曼原虫的方法,为内脏利什曼病防治提供技术支持。根据利什曼原虫动基体5.8S核糖体RNA (GenBank:OP829811)序列,设计合成LAMP扩增特异性引物,建立LAMP法。用LAMP法检测恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫感染者和健康人血样DNA,以及日本血吸虫、刚地弓形虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA,评价LAMP法的特异性评价特异性;杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA稀释为1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl,确定LAMP法的最低检测限及有、无钙黄绿素对检测限的影响。用建立的LAMP法和实时荧光定量PCR (qPCR)检测不明原因发热患者和健康人血样;取阳性患者骨髓涂片吉氏染色后镜检,查找利什曼原虫无鞭毛体。建立的LAMP法可检出杜氏利什曼原虫DNA,反应结果呈绿色;检测4种疟原虫感染者和健康人血样以及日本血吸虫、刚地弓形虫DNA的结果均为阴性,呈橙色。LAMP法检测健康人血样46份,均呈阴性,无交叉反应,特异性高。65℃反应60 min,未加和加钙黄绿素的检出限分别为1 pg/μl和1 ng/μl,浊度速率峰值均值分别为0.194、0.120,加钙黄绿素后出现浊度时间较未加钙黄绿素平均延迟23.6 min。LAMP法和qPCR法检测发热患者血样67份的结果一致,均检出相同的2份阳性,2份阳性血样对应的骨髓涂片镜检均查见利什曼原虫无鞭毛体。本研究建立的了检测利什曼原虫的LAMP法操作简便、灵敏度和特异性均较高,检测结果可视,具有较好的推广应用价值。

武汉市输入性恶性疟原虫kelch13基因C580Y位点突变监测分析

目的 了解武汉市输入性恶性疟原虫kelch13基因C580Y位点突变情况,为输入性恶性疟防治提供参考依据。方法 2009—2015年,采集武汉市从非洲和东南亚等疟疾流行区回国人员中确诊为恶性疟的患者血样。提取患者血样中的疟原虫DNA,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)法扩增kelch13基因,了解C580Y位点突变分布情况。结果 LAMP检测恶性疟患者血样208份,检出C580Y位点突变16份。其中2009—2012年69例非洲输入性恶性疟病例未检出突变,2013—2015年114例非洲输入性恶性疟病例检出C580Y位点突变13份,突变率为11.4%,其中南非、西非和中非的突变率分别为12.5%,9.6%和19.0%,北非和东非未检出突变病例。2009—2013年25例东南亚地区恶性疟,共检出3例,全部来自缅甸,缅甸的突变率为14.3%(3/21),东南亚地区的突变率为12.0%(3/25),和非洲地区2013—2015年的突变率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 武汉市输入性恶性疟原虫kelch13基因C580Y位点存在不同程度突变,应该加强相关抗性基因的监测和评估。

武汉市输入性恶性疟原虫多药抗性基因1相关位点突变分析

目的了解武汉市输入性恶性疟原虫多药抗性基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance 1,Pfmdr1)相关位点突变情况。方法2010-2015年,采集武汉市从非洲和缅甸等疟疾流行区回国人员中确诊为恶性疟的患者血样。根据恶性疟原虫Pfmdr1 86、1042和1246基因位点设计巢式PCR引物,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和Eco RⅤ酶切扩增产物,分析其86、1042和1246位点的突变率。结果共检测恶性疟现症患者血样187份,全部成功扩增出Pfmdr1基因,86、1042和1246位点突变率分别为19.3%(36/187)、4.3%(8/187)和9.6%(18/187)。其中非洲输入性疟疾血样175份,86、1042和1246位点突变率分别为20.6%(36/175)、2.9%(5/175)和10.3%(18/175);缅甸输入性疟疾血样12份,其中3例检出1042位点,未检出86位点和1246位点突变。结论来自非洲的输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因86、1042和1246位点均检出点突变,来自缅甸的输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因只检出1042位点发生突变。

环介导等温扩增检测恶性疟原虫与其他疟原虫的效果评价

目的采用环介导等温扩增(LAMP)方法检测疟原虫DNA,并评价其检测效果。方法采集2013-2018年从疟疾流行区回国人员中确诊为疟疾患者的滤纸血样。根据疟原虫的18S r RNA序列,使用PrimerExplorer V5软件设计恶性疟原虫与非恶性疟原虫LAMP引物,建立疟原虫LAMP检测方法,进行敏感性、特异性、灵敏度和扩增效率评价,并与巢式PCR比较。检测钙黄绿素指示剂对LAMP反应的影响。结果LAMP和巢式PCR各检测96份疟疾患者血样(47份恶性疟血样和49份其他疟疾血样),均检出93份疟原虫阳性。LAMP检测结果显示,恶性疟血样均被检出,非恶性疟假阴性率为2.1%, 10份利什曼原虫玻片血、8份日本血吸虫感染兔血和38份健康人血均为阴性,与巢式PCR检测结果具有极高的一致性(Kappa值=0.956)。LAMP检测恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫的灵敏度分别为25、3、4、2个疟原虫/μl血。扩增效率检测结果显示,4种疟原虫LAMP反应出现浊度时间(Tt值)均小于60 min,速率曲线峰值(Df)达0.14以上,其中恶性疟原虫扩增效率较高,Tt值为20.4 min, Df达0.16。可视化LAMP检测结果显示,钙黄绿素指示剂对不同种疟原虫LAMP反应延时约8~22 min, Df下降约21%~35%。结论 LAMP技术检测疟原虫有高度敏感性、特异性和灵敏度,且可视,具有在现场及基层医疗机构应用前景。

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式PCR检测。结果采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi和变种型wallikeri分别扩增出800 bp和780 bp目的条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%(2/49)、12.2%(9/74)、8.2%(4/49)、11.4%(4/35),卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR检测,避免误诊。

输入性恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因突变关联性分析

目的了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗性基因1(pfmdr1)相关位点突变情况及其关联性。方法 2009-2016年,采集武汉市从非洲和东南亚等回国人员恶性疟患者血样,利用巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv对产物进行酶切,分析相关位点的突变性。结果 232例输入性恶性疟患者Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点的突变率分别为55.2%、17.2%、5.2%和8.6%,pfmdr1总突变率为26.3%;东南亚患者血样未检出pfmdr186和pfmdr11246位点突变;非洲输入性恶性疟患者Pfcrt76突变和未突变中pfmdr186、1042、1246位点及pfmdr1总突变率分别为28.6%、3.8%、12.4%、36.2%和10.4%、2.1%、7.3%、17.7%。患者症状与Pfcrt76、pfmdr186、1042、1246位点突变连锁不平衡分析,D′和r^2分别为0.230和0.018、0.290和0.004、0.996和0.012、0.150和0.035。结论输入地为非洲和东南亚缅甸的恶性疟原虫pfmdr1基因突变位点存在差异,Pfcrt76突变与pfmdr1突变和pfmdr186点突变呈正相关。

武汉市输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1、2基因分型研究

目的了解武汉市输入性恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)裂殖子表面蛋白1(merozoite surface protein 1,MSP1)和MSP2的等位基因型特征。方法于2010-2015年采集武汉市从非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,收集患者流行病学资料。提取患者血样中的恶性疟原虫DNA,采用巢式PCR分别扩增恶性疟原虫MSP1、MSP2基因型特异性片段,分析各等位基因型的构成比和不同感染来源地患者的基因型频数分布,分析重症患者不同基因型的相关性。不同基因型的重症患者比例差异采用χ~2检验。结果共采集输入性恶性疟患者血样175份,其中轻度症状患者血样137份,重症患者血样38份。巢式PCR结果显示,MSP1等位基因K1、RO33、MAD20型分别扩增出260~390、270和150 bp目的条带;MSP2等位基因3D7、FC27型分别扩增出200~330、330~500 bp目的条带。MSP1和MSP2基因均未检出的有9份。检出MSP1等位基因136份,检出率为77.7%,等位基因MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33、MAD20+K1+RO33型的构成比分别为5.1%(7/136)、37.5%(51/136)、20.6%(28/136)、5.9%(8/136)、4.4%(6/136)、16.9%(23/136)、9.5%(13/136)。检出MSP2等位基因143份,检出率为81.7%,FC27、3D7和FC27+3D7型的构成比为20.2%(29/143)、39.9%(57/143)、39.9%(57/143)。MAD20型和K1以南非最多,分别占10.5%(4/38)和34.2%(13/38);RO33型以东非最多,占2/7;FC27型东非和北非均未检出,南非占比最高,为18.4%(7/38);3D7型以东非最多,占4/7。MSP1基因MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33、MAD20+K1+RO33型的重症患者分别占1/7、19.6%(10/51)、32.1%(9/28)、1/8、4/6、13.0%(3/23)、46.2%(6/13),MAD20+RO33、MAD20+K1+RO33和RO33(P>0.05),与其他4种基因型间差异有统计学意义(P<0.05)。MSP2基因3D7、FC27、FC27+3D7型的重症患者比例分别为19.3%(11/57)、20.7%(6/29)、24.6%(14/57),各基因型间差异无统计学意义(P>0.05)。结论武汉市输入性恶性疟原虫MSP1存在MAD20、Kl和R033等3种单基因型以及4种多基因型,以K1型和R033型为优势基因型;MSP2存在FC27、3D7和FC27+3D7型,3D7型的比例大于FC27型。