马源人乳头瘤病毒23型E2基因的遗传变异分析

为调查马源人乳头瘤病毒(HPV)23型(HPV-23)在马群中的流行及遗传变异情况,本研究对413份马流产胎儿组织和20份马场工人鼻拭子样品经PCR检测,结果显示,在纯血马和伊犁马流产胎儿组织样品中均检出HPV-23,阳性率分别为4.3%(2/46)和9.3%(34/367),表明马流产胎儿携带HPV-23,该病毒可能导致马的流产;在马场工人鼻拭子样品中也检出HPV-23,阳性率为60%(12/20)。将其中12份检测为HPV-23阳性的样品进行E2基因的PCR扩增测序后,采用MegAlign7.1.0软件分析本研究获得的HPV-23 E2基因与GenBank中相关病毒参考株E2基因的同源性,并采用MEGA7.0.26软件构建人源与马源HPV-23 E2基因的进化树,分析其遗传进化特征。同源性分析结果显示,本研究测序的8株马源及4株人源HPV-23 E2基因与氨基酸序列的同源性均为100%,与国外2株人源HPV-23 E2基因序列的同源性为98.9%~99.2%,提示马源HPV-23可能来源于人。遗传进化分析显示,本研究鉴定的马源及人源HPV-23与国外人源HPV-23形成独立进化分支,且同处于β进化分支,与马乳头瘤病毒处于不同分支,进一步表明马源HPV-23可能来源于人。本研究首次在马流产胎儿组织中检测到HPV-23,提示该病毒可能导致马的流产,可能是人源HPV-23感染马,该结果为动物源HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。

马源人乳头瘤病毒23型的鉴定及遗传进化分析

为了解新疆北疆地区旅游骑乘马携带人乳头瘤病毒(HPV)的类型,本研究利用高通量测序技术检测北疆伊犁地区52匹纯血马、昌吉市100匹纯血马和乌鲁木齐市30匹汗血马鼻拭子样品携带HPV的类型。病毒组学分析显示,马鼻拭子携带HPV 23型(HPV-23)。根据注释到的人源HPV-23 E2基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测并测序后分析HPV E2基因的同源性及遗传进化关系。结果显示,乌鲁木齐市汗血马鼻拭子样品HPV-23阳性率为16.7%(5/30),伊犁地区和昌吉市纯血马鼻拭子样品HPV-23阳性率分别为2%(1/52)、1%(1/100),表明旅游景区骑乘纯血马和汗血马携带HPV-23,携带病毒阳性率与马匹品种有关。马源HPV-23 E2基因与国外人源HPV-23 E2基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为98.2%~99.4%、95.5%~99.1%,与马乳头瘤病毒(EcPV)E2基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为44.2%~55.1%、18.2%~29.4%。遗传进化分析显示马源HPV-23与国外人源HPV-23亲缘关系较近,而与EcPV处于不同分支,提示马源HPV-23可能来源于人。本研究首次检测到马源HPV-23,并对其E2基因进行遗传进化分析,为动物源HPV-23的流行病学研究提供了参考依据。

马源人乳头瘤病毒18型的鉴定及遗传进化分析

为了解新疆地区马携带病毒的多样性,本研究采集新疆昌吉市和伊宁市30匹纯血马,147匹本土马粪便、鼻拭子和血清样品,采用高通量测序检测马携带病毒多样性。结果显示马粪便携带人乳头瘤病毒18型(HPV18)。根据GenBank中HPV18参考株E6基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测。结果显示20%(6/30)纯血马粪便样品携带HPV18,与其同场饲养的本土马粪便样品HPV18阳性率为12.7%(7/55),非同场饲养的本土马粪便样品HPV18阴性(0/92),表明马源HPV18可能是由纯血马携带的病毒。此外,马鼻拭子和血清样品中未检测到HPV18,表明该病毒可能仅存在于马肠道中,这也是本研究首次在动物肠道中检测到HPV18。马源HPV18 E6基因核苷酸和氨基酸序列与国外HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为99.6%~100%、100%,与我国HPV18 E6基因与氨基酸序列同源性为94.6%~97.3%、91.8%~96.8%,与马乳头瘤病毒E6基因与氨基酸序列同源性为35.8%~40.1%、14.6%~24.6%。遗传进化分析显示马源HPV18与国外HPV18亲缘关系较近,而与马乳头瘤病毒处于不同分支,表明马源HPV18可能是由纯血马携带的外来病毒。本研究首次鉴定了马源HPV18并对其E6氨基酸进行遗传进化分析,为HPV18的流行病学研究提供了参考依据。

新疆地区马呼吸道致病病毒的检测及其遗传进化分析

为了解致汗血马马驹呼吸道疾病的病原,本研究采集新疆乌鲁木齐市南山某汗血马马场82份汗血马的鼻拭子样品(包括4匹患呼吸道疾病的汗血马马驹、6匹健康汗血马马驹和72匹成年健康汗血马),经处理鼻拭子样品、提取病毒RNA、反转录、经PCR扩增及产物纯化后由公司进行高通量测序和宏病毒组学分析。结果显示,与健康马相比,患病马驹鼻拭子样品核酸有1 050条reads注释到马疱疹病毒2型(Equid herpesvirus-2,EHV-2)gB基因,且与EHV-2参考株g B基因序列同源性为91.0%~99.3%,初步表明患病马驹鼻拭子样品携带EHV-2。为验证病毒组学结果,参照EHV-2 G9/92(KM924294)gB基因序列,设计引物,经PCR扩增82份汗血马的鼻拭子样品。PCR结果显示患呼吸道疾病马驹鼻拭子样品均扩增出了EHV-2 gB基因片段,EHV-2阳性率为100%(4/4),而健康马驹和成年汗血马鼻拭子样品均呈阴性结果(0/78),表明EHV-2可能与马驹呼吸道疾病有关。同源性分析结果显示,4株EHV-2之间g B基因和氨基酸序列的同源性分别为94.1%~100%和92.0%~100%,与英国、波兰、瑞士、德国和澳大利亚参考株g B基因和氨基酸序列同源性分别为91.0%~99.3%和89.6%~98.2%。gB氨基酸序列遗传进化分析显示,4株EHV-2与波兰、英国参考株处于同一分支,亲缘关系较近。氨基酸位点分析结果显示,4株EHV-2 g B基因编码氨基酸序列均有一些位点发生了突变,主要位于gB蛋白羧基端,表明4株EHV-2 gB基因具有遗传变异多样性。本研究首次在国内马匹中检测到EHV-2,为EHV-2感染致马驹呼吸道疾病的防控及其流行病学研究提供基础数据。

新疆部分地区马疱疹病毒2型gB基因遗传变异分析

马疱疹病毒2型(EHV-2)是引起马流产的重要病原之一,严重危害马产业的健康发展。为了解EHV-2在流产伊犁马中的流行态势,本研究利用PCR方法检测从新疆伊犁昭苏县6个规模化马场及周边散养户采集的93份马流产胎儿肺组织样品,结果显示,3份伊犁马流产胎儿样品携带EHV-2,阳性率为3.2%(3/93)。同源性分析结果显示,鉴定的3株EHV-2 gB基因序列和氨基酸序列之间的同源性分别为99.9%~100%、99.6%~100%;与澳大利亚、巴西、德国、冰岛、波兰、英国及中国EHV-2参考株gB基因和氨基酸序列的同源性分别为91.6%~96.4%和90.8%~96.2%;与EHV-2新疆参考株CJ-31-06和CJ-07相比,该3株EHV-2 gB氨基酸序列有12个位点发生突变,而与其他参考株gB氨基酸序列比对显示有26个氨基酸位点发生突变,表明3株EHV-2 gB基因具有遗传变异多样性。遗传进化分析显示鉴定的3株EHV-2与波兰、英国、瑞士EHV-2参考株处于同一进化分支,亲缘关系较近,与引起新疆马呼吸道疾病的EHV-2参考株处于不同进化分支。本研究首次在国内伊犁马流产样品中检测到EHV-2,并对其gB基因进行遗传进化分析,为我国EHV-2感染的防控及流行病学研究提供基础数据。

马源人乳头瘤病毒115型E6基因的遗传变异分析

乳头瘤病毒(PV)是人类和动物的一种重要病原体,具有严格的宿主特异性。已报道14种PV可以感染马,其中在我国新疆地区发现马携带马乳头瘤病毒1型(EcPV-1)、人乳头瘤病毒18型(HPV-18)和HPV-23。为进一步调查新疆地区马匹携带PV的类型,本研究利用高通量测序和病毒宏基因组学技术检测伊犁、昌吉3个规模化马场和乌鲁木齐1个马术俱乐部395份样品(205份鼻拭子、140份粪便样品及50份马流产胎儿肺组织样品)携带PV的类型。病毒组学分析显示,马可能携带HPV-115。根据注释到的HPV-115 E6基因序列,设计特异性引物,对所有马及人鼻拭子样品进行E6基因的PCR检测,结果显示,伊犁地区B场马鼻拭子样品中的HPV-115阳性率为7.3%(6/82),其他马场及马术俱乐部的纯血马和汗血马均为阴性,表明HPV-115可以跨种感染马。另外该病毒在B场马流产胎儿肺组织样品中的阳性率为46%(23/50),表明马感染HPV-115可能导致流产。进一步调查显示,HPV-115在马场工人和有阳性马场接触史的人群鼻拭子样品中的阳性率为59.5%(25/42),而无马匹接触史人员鼻拭子样品则呈阴性(0/20),表明该马源HPV-115有经马感染人的风险。同源性分析结果显示本研究测序获得的11株HPV-115 E6基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.0%~100%、98.1%~100%;与人源HPV-115参考株GC02 E6基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.4%~99.0%、97.1%~99.0%;与EcPV E6基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为32.4%~43.8%、34.6%~45.4%。E6基因的遗传进化分析显示本研究鉴定的11株马源和人源HPV-115形成独立进化分支。本研究首次报道HPV-115可能导致马流产,且其具备经马感染人的风险,该结果为马源HPV感染的防制提供了参考依据。

马疱疹病毒5型的鉴定及遗传进化分析

采集乌鲁木齐某马术俱乐部226匹纯血马鼻拭子样品,用高通量测序检测纯血马携带病毒多样性,结果宏病毒组学分析共产生73664946条reads,有16067条reads(0.022%)注释为哺乳动物病毒,其中105条reads注释到马疱疹病毒5型(EHV-5)gH基因。根据GenBank中的EHV-5参考株2-141/67 gH基因序列,设计特异性引物,验证宏病毒组学结果,并对gH基因的氨基酸序列进行遗传进化分析。结果14匹健康纯血马鼻拭子样品呈EHV-5阳性,阳性率为6.2%(14/226),序列分析表明,鉴定的14株EHV-5 gH基因的核苷酸和氨基酸序列与澳大利亚、意大利及日本分离株gH基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.4%~100%和90.3%~100%。遗传进化分析显示我国14株EHV-5与澳大利亚2-141/67和EHV-5.2-141株亲缘关系较近,而与意大利glycoprotein H株、日本16-I-1064和1-I-790株处于不同分支。

Ⅷ群神经致病型马疱疹病毒1型的分离及鉴定

为研究伊犁马是否存在Ⅷ群神经致病型马疱疹病毒1型(EHV-1)的感染,并分析其遗传进化特征,本研究采集新疆伊犁昭苏县某马场93份伊犁马流产胎儿肺组织样品,经PCR鉴定为EHV-1阳性后,将部分EHV-1阳性的肺组织研磨上清液接种MDBK细胞,盲传3代,待出现细胞病变时收集细胞及培养上清,通过PCR及透射电镜对EHV-1进行鉴定,并对其进行不同基因的遗传进化分析。结果显示,93份临床样品中有43份样品呈EHV-1阳性。将其中11份阳性样品接种MDBK细胞盲传3代后,有4份出现细胞病变,电镜观察可见疱疹病毒典型的形态特征,且均经PCR检测到EHV-1 g B基因,表明分离到4株EHV-1,分别命名为XJ-YLZS-21、XJYLZS-22、XJ-YLZS-29和XJ-YLZS-31。同源性分析结果显示,4株EHV-1分离株gB基因序列与EHV-1参考株Ab4相应基因序列的同源性为100%。ORF30基因序列分析结果显示,4株分离株第2 254位均为鸟嘌呤(G),编码天冬氨酸(D),表明4株EHV-1分离株为神经致病型EHV。ORF68基因及其编码氨基酸序列的遗传进化分析结果显示,4株EHV-1分离株的核苷酸及氨基酸序列同源性均为100%,并处于独立的进化分支,将其划分为Ⅷ群神经致病型EHV-1。本研究首次在国内鉴定并分离到Ⅷ群神经致病型EHV-1,丰富了EHV-1的流行病学数据库,为EHV-1感染所致马流产的防控奠定了流行病学基础。

不同宿主源柯克病毒的HP4基因特征及遗传进化分析

为了解新疆地区柯克病毒(kirkovirus)宿主范围及其遗传多样性,本研究采集新疆阿拉山口市、和田市、昌吉市、哈密市和阿勒泰地区130匹纯血马、547峰骆驼、217头新生仔猪、73头驴、76只羊和86头牛共计1129份肛拭子样品。利用kirkovirus假定蛋白4基因(Hypothetical protein 4,HP4)通用引物,对样品进行PCR检测。结果显示马、猪、驴、羊和牛肛拭子样品的病毒阳性率分别为26.9%(35/130)、65.4%(142/217)、27.4%(20/73)、65.8%(50/76)和30.2%(26/86),表明kirkovirus在不同宿主广泛分布。其中,新生仔猪腹泻样品的病毒阳性率为100%(141/141),而新生健康仔猪样品中的阳性率为1.3%(1/76),提示该病毒感染可能与新生仔猪腹泻有关。马、驴、牛、羊和猪源kirkovirus之间HP4基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.4%~100%、62.8%~100%,表明kirkovirus HP4基因具有遗传变异多样性。猪源kirkovirus Porcine-34株与其他27株kirkovirus HP4的核苷酸和氨基酸序列的同源性最低,分别为81.4%~88.1%、62.8%~72.1%,其中有43个碱基位点是其特有的,对应33个氨基酸位点的突变。另外,HP4氨基酸序列遗传进化分析显示猪源kirkovirus Porcine-34株在进化树中形成一个独立进化分支,远离其余27株猪、马、牛、羊和驴源kirkovirus形成的另一进化分支,上述结果表明猪源kirkovirus Porcine-34株可能是新的病毒亚型。本研究首次鉴定了新疆地区不同宿主源kirkovirus并对其HP4基因进行遗传进化分析,发现该病毒在不同宿主广泛分布,为kirkovirus的流行病学研究提供了参考依据。

马源人巨细胞病毒的鉴定及遗传进化分析

为了解伊犁马携带病毒的类型,本研究利用高通量测序技术检测伊犁昭苏县142份伊犁马马驹鼻拭子样品。病毒组学分析显示,伊犁马马驹鼻拭子样品携带人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV),根据注释到的HCMV UL126基因序列,设计特异性引物,对样品进行PCR检测。结果显示,伊犁马马驹鼻拭子样品HCMV阳性率为7%(10/142),进一步调查显示伊犁马流产胎儿肺组织样品中该病毒阳性率为57%(53/93),表明该病毒感染伊犁马。另外,研究表明马场工作人员HCMV阳性率为37.5%(15/40),且大部呈HCMV阳性马驹和流产的妊娠母马都和HCMV阳性工作人员有密切接触史,提示马源HCMV可能来源人。核苷酸同源性分析显示本研究鉴定的马源和人源HCMV UL126基因的核苷酸序列同源性为99.6%~99.8%,与国外人源HCMV UL126基因的核苷酸序列同源性为97.8%~100%。遗传进化树分析显示本研究鉴定的HCMV与美国人源HCMV亲缘关系较近。本研究首次鉴定马源HCMV,为其致伊犁马流产防控和动物源HCMV流行病学调查奠定基础。