柯萨奇病毒A组10型的生物学特征和免疫原性分析

目的 探究柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10, CV-A10)毒株在Vero细胞上合适的扩增条件,并评价该候选CV-A10疫苗病毒株的免疫原性。方法 将CV-A10按照感染复数(multiplicity of infection, MOI) 0.01、0.02、0.05分别接种于Vero细胞,在感染后不同时间点进行病毒样本采集,检测各时间点病毒样本的CV-A10 VP1基因拷贝数及病毒感染滴度,绘制病毒增殖动力学曲线。再使用密度梯度离心法对超滤浓缩的CV-A10病毒收获液进行纯化,SDS-PAGE凝胶电泳确定病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的完整性,电镜观察纯化后病毒颗粒的形状。将灭活后的CV-A10病毒液肌肉注射C57BL/6小鼠,分成2个免疫剂量组(25μg、10μg),于0、21 d进行初次免疫及加强免疫,每次免疫21 d后检测小鼠血清中和抗体水平,用ELISpot实验检测小鼠体内的T细胞免疫应答效果。结果 在CV-A10接种MOI=0.05的情况下收获病毒液,CV-A10能在感染Vero细胞后24~30 h达到增殖高峰,并且最高的感染性滴度均值在7.3 CCID_(50)/mL。在MOI=0.05的条件下对病毒进行大规模培养,通过密度梯度离心可观察到病毒颗粒条带;进一步对该病毒聚集带进行SDS-PAGE凝胶电泳,可观察到CV-A10主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的蛋白条带;在透射式电子显微镜下可观察到完整的CV-A10病毒颗粒。将纯化的CV-A10抗原进行小鼠免疫,加强免疫后10μg剂量组和25μg剂量组的中和抗体几何平均滴度值(geometric mean titer, GMT)分别为30.9、108.3;通过ELISpot实验检测发现2个剂量组均能较好的诱导IL-4和IFN-γ特异性的细胞免疫反应。结论 CV-A10在MOI=0.05条件下可以快速增殖并获得较高滴度的病毒上清液,并获得成熟的病毒颗粒,该病毒灭活后可以在小鼠体内较好的诱导免疫原性,对后续CV-A10灭活疫苗的开发具有一定的指导作用。