整合素连接激酶基因敲除骨肉瘤细胞系的建立及其对上皮-间质转化的影响

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人整合素连接激酶ILK基因敲除的人骨肉瘤U2OS细胞系,探讨ILK敲除对骨肉瘤细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法首先在人ILK基因的第2,4,6外显子区域选取序列,分别设计3组靶向ILK的sgRNA,退火后与酶切lentiCRISPRv2慢病毒质粒连接,构建含有sgRNA的重组质粒,重组载体与病毒包装质粒共转染293T细胞后获得慢病毒颗粒;将病毒颗粒感染U2OS细胞,经嘌呤霉素筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,通过测序、qRT-PCR及Western blot鉴定ILK基因稳定敲除细胞系,并进一步通过Western blot检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、Snail1、Snail2、Twist等EMT相关标记分子以及Akt的磷酸化水平。结果构建了3组lentiCRISPRv2-ILK-sgRNA敲除质粒,经慢病毒感染U2OS细胞后及单细胞克隆株的筛选鉴定后得到了一株含有ILK等位基因突变的细胞,Western blot证实ILK^(-/-)细胞中ILK蛋白表达缺失;相比野生型,ILK^(-/-)细胞中N-钙黏蛋白、Snail1、Snail2及Twist蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),而E-钙黏蛋白表达则显著升高(P<0.05);与野生型细胞相比,ILK^(-/-)细胞Akt通路的磷酸化水平显著降低(P<0.05),而经TGF-β1处理后,相比野生型细胞,ILK^(-/-)细胞中Akt激活水平亦显著下降(P<0.01)。结论成功构建ILK^(-/-)U2OS细胞系,敲除ILK可能通过下调Akt信号通路抑制U2OS细胞的EMT进程。

医学微生物学教学改革的探索与体会

医学微生物学在医学专业课中占有重要地位,是基础医学与临床医学之间的桥梁课程。为不断提高本课程的教学质量,培养具有全面素质的医学人才,结合本教研室的多年教学实践,我们从授课内容、教学模式以及人才培养理念这三个方面进行了探讨。

PBL教学法不适用于低年级临床医学生课程

对遵义医学院珠海校区2013级和2015级临床医学系学生发放调查问卷,统计分析比较高年级和低年级临床医学生对PBL接受程度的差异。结果:高年级学生对于PBL接受度明显高于低年级学生;大多数被调查者认为PBL增加了学习工作量和学习压力,应该在大学三年级以后开展。结论:PBL教学法不适用于低年级临床医学生课程。

人用狂犬病疫苗和被动免疫制剂研发进展

狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(Rabies virus)引起的一种人兽共患病。人一旦发病致死率几乎100%。目前预防狂犬病的人用疫苗为狂犬病毒灭活疫苗。随着基因工程技术的进步,新一代以狂犬病毒G蛋白(Glycoprotein)为免疫原的疫苗在开发中,包括不同表达系统的G蛋白亚单位疫苗,G蛋白DNA疫苗,G蛋白病毒载体疫苗等。同时本文还探讨了未来可能取代狂犬病免疫球蛋白的被动免疫制剂(单克隆抗体)的研发进展。

软骨寡聚基质蛋白与疾病关系的研究进展

软骨寡聚基质蛋白(COMP)为细胞外基质(ECM)中的非胶原糖蛋白,通过其不同结构域与组织中的多种ECM、细胞表面黏附分子、生长因子等相互作用,参与了多种疾病的发病过程,并发挥不同作用。本文就COMP的基本结构、功能,以及在骨关节系统病变、心血管系统疾病、组织纤维化和癌症等疾病发生过程中发挥的作用进行了综述。

基于超星网络教学平台在微生物学教学改革中的应用

根据生物工程专业的特点,对微生物学的教学内容、考核方式进行了改革,同时采用多种教学方式进行教学,尤其是超星网络教学平台的应用,大大提高了学生的学习兴趣和考试成绩。

主动脉瓣膜间质细胞分化机制研究进展

瓣膜纤维化或钙化是瓣膜性心脏病(VHD)的两大重要病理表现,其中瓣膜间质细胞(VICs)由成纤维细胞样表型分化为肌成纤维细胞表型或成骨细胞表型,是瓣膜发生早期病理改变的关键环节。VHD多累及主动脉瓣,近年来有关VICs分化的研究多聚焦于主动脉瓣来源细胞。本文就主动脉瓣VICs分化的最新研究进展予以综述,旨在为VHD的防治研究提供更为全面的参考。

禽流感病毒对人类致病的研究概述

禽流感病毒是广大民众熟知的一种流感病毒,谈起它无不让人为之变色,原因主要是禽流感病毒不仅可以感染禽类牲畜,还可以感染人类。但民众对它的致病性缺乏人虱,甚至有些媒体对禽流感病毒的报道过于危言耸听,造成广大民众的恐慌。本文从禽流感病毒的生物学特征、对人类的致病性以及禽流感病毒的检测与预防方法几方面进行了阐述,旨在为人们正确认识禽流感病毒并且能够正确地应提供一些基础性的建议。

携带β-内酰胺酶基因的表达载体在哺乳动物细胞表达系统中应用风险评估

β-内酰胺酶基因(青霉素抗性基因)是克隆和表达载体常用的筛选标记。因β-内酰胺类抗生素如青霉素为强致敏原,《中华人民共和国药典》规定,在重组蛋白药物生产过程中,除另有规定外,不得使用青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺类抗生素具有杀细菌能力而无杀细胞能力,哺乳动物细胞培养过程中不需要添加β-内酰胺类抗生素以维持载体拷贝数和产量。但是β-内酰胺酶基因是否会给在哺乳动物细胞表达的重组蛋白带来潜在风险?本文就此进行了系统风险评估。

通过基于iTRAQ的蛋白组学方法筛选与TGF-β1调控瓣膜间质细胞活化相关的关键蛋白

瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)由成纤维细胞表型分化为肌成纤维细胞表型,即VICs活化是驱动瓣膜纤维化病变的早期关键环节,而转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是诱导VICs活化的经典细胞因子,该文利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对TGF-β1处理前后的VICs进行了差异蛋白质组学分析,以期发现与VICs活化相关的关键蛋白。该研究以原代培养的大鼠VICs为对象,利用蛋白组学方法分析TGF-β1处理VICs前后蛋白质表达谱的变化,通过多种生物学信息分析方法对重点差异蛋白进行筛选,并利用qRT-PCR与Western blot法验证候选蛋白的表达差异。结果显示,共鉴定出可定量差异蛋白7104个,其中包括具有显著差异(P<0.05)的上调蛋白404个、下调蛋白494个。GO分析显示差异蛋白主要富集到多细胞生物学过程、DNA结合功能以及细胞外基质区域组分等功能条目中,KEGG分析显示差异蛋白主要参与DNA复制、错配修复及黏着斑等信号通路。此外,进一步发掘出了AKAP12、FBLN2、NCAM1、MFAP4以及CADM4等5种与VICs活化相关的新型候选蛋白。该研究全面解析了TGF-β1处理前后的VICs差异蛋白表达谱,为进一步阐明VICs活化与瓣膜性心脏病的发生机制提供了新的线索。