人粘膜血管定居因子/GST融合基因表达载体的构建与表达

目的构建 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体并进行表达。方法采用 PCR技术扩增 h MAd CAM- 1c DNA5 '端 615 bp的基因片段 ,将其插入 p GEM- T质粒中 ,经全自动序列分析仪测序证实后 ,再亚克隆至表达载体 p GEX- 2 T,转化大肠杆菌 DH 5 a表达。结果 SDS- PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 5 2 0 0 0 u的融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 3 1%左右。West-ern blot分析表明 ,表达蛋白能与抗 h MAd CAM- 1多抗特异性结合。结论 h MAd CAM- 1/ GST融合基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究 MAd CAM- 1提供了材料。

用BA－ELISA斑点法检测痢疾杆菌免疫小鼠GALT中的特异性抗体分泌细胞（ASC）

改进的ＢＡ－ＥＬＩＳＰＯＴ法使免疫酶斑更为清晰，保存时间延长。用此法检测了痢疾杆菌福氏２ａ经口及腹腔免疫后，小鼠派伊尔氏（ＰＰ）淋巴结、肠系膜淋巴结（ＭＬＮ）及脾脏（ＳＰＬ）中特异性ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体分泌细胞（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｅｃｒｅｔｉｎｇｃｅｌｌ，ＡＳＣ）的动态变化，得到有规律的结果：两种免疫途径均能在ＰＰ及ＭＬＮ中诱导出３类特异ＡＳＣ的显著升高，但口服导致的升高其持续时间较腹腔途径为短。此外，腹腔途径还能诱导ＳＰＬ中３种ＡＳＣ升高。

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。

有关小肠粘膜上皮内淋巴细胞的研究进展

与外周血Ｔ细胞相比较，小肠粘膜上皮内淋巴细胞（ＩＥＬ）在很多方面均表现出其独特的性质，如：在定位方面显示出对上皮有特殊的亲嗜性；表达复杂的在型特征且大多缺乏Ｔ细胞标志；存在着独立于胸腺之外而分化成熟的细胞亚群；严格的回归限制性；具抑制粘膜超敏反应、细胞毒作用及分泌淋巴因子等多种功能等等。随着有关研究的不断深入，提示这群淋巴细胞与其他肠道粘膜相关淋巴组织构成一个复杂的免疫器官。在肠道免疫防御中起着重要作用。本文主要综述了近年有关ＩＥＬ的分布、表型特征、起源、回归及功能等方面的研究进展。

抗人粘膜地址素-1单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗人ＭＡｄＣＡＭ－１单克隆抗体（ｍＡｂ）。 方法以重组人ＭＡｄＣＡＭ－１胞外区蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备ｍＡｂ。结果获得１０株可分泌特异性ｍＡｂ的杂交瘤细胞，其腹水ｍＡｂ的效价为３．２×１０５～１．９×１０６，ｍＡｂ的Ｉｇ亚类均为ＩｇＧ１，其中，８株ｍＡｂ的轻链属κ型，２株为λ型。应用于免疫组化染色法，检测表明，正常成人小肠、附睾及前列腺组织中存在ＭＡｄＣＡＭ－１阳性表达的血管内皮细胞。结论 成功地研制出抗人ＭＡｄＣＡＭ－１的ｍＡｂ，为进一步研究ＭＡｄＣＡＭ－１在肠道黏膜免疫中的作用提供了有用的试剂。

人神经营养素-3基因的克隆、表达及其活性检测

为了获取神经营养素 -3 (NT-3 )将之用于神经系统疾病的治疗 ,采用 RT-PCR技术 ,从人胎脑组织特异性扩增并克隆了人 NT-3全长以及成熟蛋白编码基因 ,将其分别克隆至表达载体 pc DNA3 .1与 p ET2 8a,构建了重组真核表达载体 pc DNA3 .1-NT3和重组原核表达载体 p ET2 8-NT3 s。 pc DNA3 .1-NT3经脂质体介导转染至大鼠胚胎脑纹状体神经胶质细胞 ,以 G418筛选出抗性阳性克隆 ,该克隆株与大鼠胚脑纹状体神经干细胞体外共培养 5 d,MAP-2 (微管相关蛋白 2 )免疫细胞化学反应结果显示 ,转染细胞株所表达的 NT-3蛋白具有生物学活性 ,可促进共培养的纹状体神经干细胞的突起生长。将 p ET2 8-NT3 s转化大肠杆菌 ,以 IPTG诱导 ,获得了相对分子质量约 18k D的 6XHis-NT3融合蛋白 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 0 %左右。经镍柱亲和纯化 ,得到纯度达 95 %的 rh NT-3蛋白 。

人MAdCAM—1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上，选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中，转化大肠杆菌后，以IPTG诱导表达，产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示，其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白，为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。

免疫小鼠GALT部位T淋巴细胞回忆反应观测

以鼠伤寒杆菌减毒株Ｇ３０经口免疫小鼠两次，间隔３或５个月后再刺激，应用间接免疫荧光法检测了小鼠派伊尔氏（ＰＰ）淋巴结、肠系膜淋巴结（ＭＬＮ）及脾脏（ＳＰＬ）中Ｌ３Ｔ４、ＬＹＴ２Ｔ细胞亚群变化并以ＭＴＴ法测定了ＣｏｎＡ诱导的淋巴细胞增殖反应。实验表明：Ｇ３０菌能在ＰＰ与ＭＬＮ中激发Ｌ３Ｔ４亚群及淋转的回忆反应，此外，ＳＰＬ也产生了Ｌ３Ｔ４亚群的记忆应答。提示：Ｇ３０菌确实能诱导细胞免疫应答并形成较强的免疫记忆。

洛阳地区汉族补体B因子主要同种异型遗传多态性分析

应用琼脂糖高压电泳和免疫固定技术，检测了洛阳地区健康汉族成人补体Ｂ因子的多态性。在１１９例无血缘关系个体中，Ｂｆ表型为ＳＳ７７人，ＦＳ３２人，ＦＦ１０人。计算出基因频率分别为ＢＦ＊Ｓ：０．７８１５，ＢＦ＊Ｆ：０．２１８５。与广东等南方汉族人的资料相比，其Ｂｆ遗传多态性分布有显著差异，对此进行了讨论。结果提供了具有地域特点的Ｂｆ多态性资料。

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .

MAdCAM-1分子:免疫生物学功能

有关MAdCAM 1分子生物学功能的研究目前虽属初级阶段 ,但至少已知它与淋巴归巢、肠道相关淋巴组织的发育、淋巴细胞活化及炎症反应等多种生理和病理过程有关。本文拟就其上述功能作一讨论。

核受体相关因子1的研究进展

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,主要表达于中脑黑质与腹侧被盖区 ,作为基因转录调控蛋白而参与了中脑多巴胺能神经元的发育与存活、长时记忆、肝再生及炎症等多种生理和病理过程。本文总结和讨论了有关Nurr1的编码基因、分子结构。

人MAdCAM-1分子:基因、分子结构、分布与配体

MAdCAM 1(MucosalVascularAddressinCellAdhesionMolecule 1)分子是一种免疫球蛋白超家族粘附分子 ,主要表达于肠道粘膜及其相关淋巴组织的血管内皮细胞表面 ,通过与淋巴细胞上相应配体α4 β7结合而主要介导淋巴细胞向肠道粘膜部位定向归巢。本文介绍了它的编码基因、分子结构、组织分布及配体。

Wistar大鼠SONIC HEDGEHOG基因的克隆和表达

为了获得SHH蛋白以研究它在治疗神经变性疾病中的作用 ,本室提取不同胚龄Wistar胎鼠中的总RNA ,应用RT PCR技术获得SHH N的cDNA ,重组于pGEM T载体 ,经测序鉴定后 ,构建原核表达质粒并获得表达菌株Q15 SHH N ,然后诱导SHH蛋白的表达。结果发现 ,在E11.5 E2 0 .5胎鼠的脊索中能克隆到 6 30bp的cDNA片段 ,并且随胚龄增加 ,此片段的表达量逐渐减少 ;测序结果显示 ,此片段及其所编码的氨基酸序列同数据库中人、小鼠和SD大鼠的SHH N的序列有较高同源性 ;表达菌株经诱导后产生约 2 1kD的融合蛋白。提示SHH N是一种发育相关基因 ,在不同种属中的同源性较高 。

中国洛阳地区汉族人MHC补体单倍型的分析

应用国际补体参考实验室的方法，对洛阳地区正常汉族家系１８４条染色体做了补体单倍型的检测与分析，并与南方汉族做了比较。共发现频率大于０．０１的补体单倍型１９个，频率居前３位者为ＳＣ３１（０．２１７４），ＳＣ４２（０．１６８５）和ＳＣ３２（０．１０８７），有１１个型别呈连锁不平衡。Ｂｆ，Ｃ２，Ｃ４Ａ和Ｃ４Ｂ等位基因的频率分别以ＢｆＳ，Ｃ２Ｃ，Ｃ４Ａ３，Ｃ４Ａ４，Ｃ４Ｂ１和Ｃ４Ｂ２频率居高。而且洛阳汉族ＢｆＳ，Ｃ２Ｃ和Ｃ４Ｂ３等位基因的频率明显高于广东汉族（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），显示了南北汉族间的显著差异。此外，就主要补体单倍型频率与日本人、白种人和黑种人做了比较与讨论。结论阐明了北方汉族补体单倍型的种类、频率，以及与南方汉族型别分布的差异。

神经前体细胞的增殖和分化及其对Parkinson病的治疗作用

本实验分离 1 1～ 1 5 d胎鼠的大脑皮层 ( CP)和中脑的神经前体细胞 ( MP) ,观察它们在体外的增殖和分化及其对帕金森病 ( PD)的治疗作用。结果发现 ,CP较 MP生长迅速 ,容易形成神经球 ,加入 N2 / B2 7有助于神经球的形成 ;有 /无血清分化后 ,CP和 MP都能发育成微管相关蛋白 -2 ( MAP-2 )阳性细胞 ,其中 MP倾向于发育成酪氨酸羟化酶 ( TH)阳性细胞。将 MP或 CP植入6 -OHDA损伤的大鼠纹状体后 ,MP发育成的 TH+神经元数量明显地较 CP移植组和对照组者多 ( P<0 .0 5 )且 MP移植后 4～ 8周旋转行为发生明显改善 ,与 CP移植组和对照组相比有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。上述结果提示 ,虽然 CP在体外的增殖能力较MP强 ,但 MP更易于分化成 TH阳性神经元并改善 PD大鼠的旋转行为 ,此点对于神经前体细胞治疗 PD的应用极其重要。

大鼠Shh-N融合蛋白的表达、纯化及功能研究

为了获得重组SonichedgehogN端蛋白 (Shh N)并研究其功能 ,应用PCR技术扩增Shh NcDNA ,然后克隆至原核表达质粒中 ,转化E .coli后获得表达菌株 ,经 1mmol/LIPTG诱导高效表达出带有His tag的融合蛋白 ,其中大部分为可溶性蛋白 ,少量为包涵体 .用His tag特异性结合树脂纯化可溶性融合蛋白 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一区带 ,凝胶自动扫描分析表明 ,Shh N的纯度达 85%以上 .纯化后的Shh N在成纤维生长因子 8(FGF8)的协同作用下 ,能诱导神经前体细胞 (NPC)向酪氨酸羟化酶阳性神经元 (TH+ )发育 .在此基础上可以诱导不同类型的人类干细胞定向分化为多巴胺 (DA)神经元 ,从而为临床治疗帕金森病 (PD)

分泌性BACE1蛋白在昆虫细胞的表达

为了获得有活性的重组β-secretase并研究其功能,寻找特异性抑制剂,应用RT-PCR技术,从人胚胎脑组织特异性扩增并克隆了人BACE1编码基因的胞外片断(BACE1-454)。测序后与质粒pFastBac连接,得到含BACE1-454基因的重组质粒pFast-BACE1-454。将其转化到含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,用琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对重组穿梭载体Bacmid-BACE1-454进行鉴定。将Bacmid-BACE1-454经脂质体介导转染Sf9细胞,收获病毒。用重组杆状病毒颗粒感染昆虫细胞,表达蛋白,免疫印迹证实所获蛋白产品具有特异的免疫反应性。

人BDNF的克隆、表达及其活性检测

为了研究脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Parkinson病中的作用,采用RT-PCR技术,从人胚脑组织扩增及克隆了BDNF全长及其成熟蛋白编码基因,经测序证实后,将其分别克隆至表达载体pcDNA3.1与pGEX6p-1,构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-BDNF和重组原核表达载体pGEX6p-BDNFs。pcDNA3.1-BDNF经脂质体介导转染至体外培养的E16胚鼠中脑星形胶质细胞,以G418筛选出抗性阳性克隆,该克隆株与E12-E14胚鼠中脑神经干细胞体外共培养,酪氨酸羟化酶免疫细胞化学反应显示,转染细胞株所表达的BDNF蛋白具有生物学活性,可延长前体细胞的存活并促进其向多巴肢神经元分化。将pGEX6p-BDNFs转化大肠杆菌,以IPTG诱导,获得了相对分子质量约为40 kD的GST-BDNF融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的10％,并经免疫印迹证实具有特异的免疫反应性。

洛阳地区汉族HLA—DRB1^＊04等位基因的PCR—SSO分型

对河南洛阳地区汉族进行了ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４等位基因的ＰＣＲ－ＳＳＯ分型，采用第１２届国际组织相容性专题讨论会（１２ｔｈＩＨＷＣ）推荐的引物和序列特异性寡核苷酸探针，可检测１７个ＤＲＢ１＊０４组特异性等位基因（ＤＲＢ１＊０４０１－０４１７）。在１１６份无血缘关系健康人ＤＮＡ标本中有１６份为ＤＲＢ１＊０４，其中１份为纯合，ＤＲＢ１＊０４的基因频率为０．０７１５。ＤＲＢ１＊０４等位基因分布于５个不同的型别，分别是ＤＲＢ１＊０４０１、０４０３、０４０４、０４０５和０４０６。基因频率以ＤＲＢ１＊０４０５最高（０．０２６２），ＤＲＢ１＊０４０６其次（０．０１７４），二者分别构成ＤＲＢ１＊０４基因组的３５．８％和２３．８％。其它３种等位基因的基因频率均较低（０．００８７）。此外对ＤＲＢ１＊０４等位基因在中国南北方汉族、民族（日本，中国）及人种（白种，黄种）中的分布进行了比较与讨论。将为ＨＬＡ与疾病相关性、移植免疫及人类学研究提供有价值的参考数据。