人胚胎干细胞向嗜酸性粒细胞高效定向诱导分化模型的建立

目的建立从人胚胎干细胞向成熟嗜酸性粒细胞定向诱导分化的高效体外培养模型。方法采用人胚胎干细胞与小鼠主动脉-性腺-中肾(m AGM)基质细胞共培养的方法,进行早期造血干细胞诱导分化,将诱导分化的造血干细胞进行悬浮培养,在含有血清的培养基中,分阶段添加不同细胞因子组合进行成熟嗜酸性粒细胞的定向分化和增殖。结果获得从CD34+CD45+细胞扩增了约651倍,且纯度高达95%以上,CD88+Siglec-8+EPO+的成熟嗜酸性粒细胞。结论本研究建立了1种人胚胎干细胞高效定向分化为成熟嗜酸性粒细胞的模型,为进一步深入研究嗜酸性粒细胞的早期发育调控和相关疾病的发生机制奠定了基础。

过表达TRAIL转基因人脐带间充质干细胞治疗裸鼠脑胶质瘤的研究

目的探讨建立转座子载体过表达外源肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSCs)转基因细胞系及其应用于脑胶质瘤裸鼠模型的疗效。方法自主专门设计的PiggyBac转座子过表达系统,通过嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选制备稳定表达TRAIL基因的靶向HER2型和非靶向型的2种转基因细胞。将带有萤火虫荧光素酶标记的脑胶质瘤细胞(U87MG-FLUC)接种于免疫缺陷性小鼠(BALB/c-nu/nu)颅内,接种剂量为1×10^(6)个/只,接种7 d后利用小动物活体成像仪对植瘤小鼠脑颅检测,确定颅内肿瘤的大小和位置,然后将胶质瘤裸鼠分为4组(n=8),分别注射2种表达TRAIL转基因hUC-MSCs(分别命名为target-TRAIL和untarget-TRAIL组),以及只注射非转基因hUC-MSCs(接种剂量均为1×10^(6)/只)或PBS(分别命名为WT-MSCs和PBS组,作为阴性对照),每周用小动物活体成像仪监测肿瘤信号的变化情况,约检测34周。结果2种转基因细胞经过6次传代扩增后能稳定表达TRAIL基因,流式检测:绿色荧光蛋白(GFP)阳性(共表达TRAIL基因)的细胞比例达到93%97%,且经过6次传代后均为MSC相关表面标志物CD34、CD45、HLA-DR阳性率<0.1%,CD90阳性率>99%,CD73阳性率>98%,CD105阳性率>60%。中位生存期(d):胶质瘤裸鼠经颅内注射untarget-TRAIL、target-TRAIL、WT-MSCs或PBS组分别为41 vs 39 vs 24 vs 23(P<0.05)。结论过表达TRAIL转基因的hUC-MSCs-TRAIL细胞明显延长移植了脑胶质瘤的裸鼠的生存时间。

人胚胎干细胞来源红系细胞膜蛋白表达的研究

目的探讨人胚胎干细胞(h ESCs)来源红系细胞在发育过程中其膜蛋白,包括膜表型分子、膜骨架蛋白和跨膜蛋白的表达情况。方法 h ESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾(m AGM-S3)基质细胞共培养产生造血干祖细胞(CD34+CD45+)和GPA+细胞,挑取共培养12 d的细胞,同时磁珠分选人脐血中的CD34^+细胞,在多种特定细胞因子SCF、IL-6、IL-3、FLT3-L、TPO、EPO等诱导下,分别进行集落培养12-14 d产生红系爆发式集落形成单位(BFU-E),运用流式细胞术(FACs)、qRT-PCR和免疫荧光染色等方法检测并比较hESCs和人脐血CD34^+细胞2种来源的红系细胞膜蛋白的表达情况,并以后者作为对照组。结果 hESCs来源BFU-E的膜蛋白的表达趋势与对照组相近:其膜骨架蛋白和跨膜蛋白的基因,如SPTA、SPTB、ANK1、EPB41等基因转录水平都在逐渐增强,而一些膜蛋白如黏附分子CD49d、CD29、CD71等的表达逐渐降低,CD47基本不表达;带3蛋白(Band 3)表达量较高且与成体型血红蛋白β-globin的表达呈正相关。结论在hESCs向红系诱导生成过程中,一些膜表型分子表达在逐渐降低,而膜蛋白表达逐渐增强。

人胚胎干细胞高效诱导产生巨噬细胞方法的建立

目的利用人胚胎干细胞(h ESCs)建立高效巨噬细胞体外诱导分化体系,并与人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞进行比较。方法通过将h ESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾(m AGM)来源的基质细胞共培养产生CD34+CD45+造血干祖细胞,在多种细胞因子的诱导下悬浮培养14 d,利用May-Grünwald Giemsa染色、流式表面抗原及功能检测等方法对我们培养的巨噬细胞和人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞进行比较鉴定。结果该方法可产生大量高纯度的巨噬细胞,成功的建立了体外高效诱导的巨噬细胞分化体系,并且该体系获得的巨噬细胞与人脐带血CD34+细胞来源的巨噬细胞具有相似的表型和功能。结论建立高效巨噬细胞体外诱导分化体系,为进一步研究人类巨噬细胞的早期发育和建立相关疾病模型提供了可靠的方法。

胶原支架促进人类多能干细胞向红细胞的诱导分化

目的建立人胚胎干细胞（hESCs）来源的造血干/组细胞向红细胞分化的体外3D培养方法。方法hESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾区（AGM-S3）基质细胞共培养14 d后获得CD34^＋CD45^＋造血干/祖细胞,对获得的CD34^＋CD45^＋细胞扩增5 d后,以相同初始接种数量分别接种于胶原水凝胶、透明质酸水凝胶、Ⅰ型胶原蛋白构建的三维（3D）支架材料（简称胶原支架）中,在体外模拟骨髓微环境,做红细胞定向分化,以普通液体悬浮培养（简称液体培养）为对照,通过MGG染色、流式细胞术、免疫染色、qRT-PCR等手段分别对收获的细胞做形态学、红系特异性表面标志表达情况、红系细胞成熟程度以及红系细胞发育过程中相关基因的表达情况分析。结果红系定向分化14 d后,胶原支架中收获的总细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.50、1.19、1.33倍,GPA^＋CD71^＋细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.55、1.25及1.48倍;GPA^＋CD36^＋细胞数量分别是液体培养、透明质酸水凝胶、胶原水凝胶的1.65、1.07、1.36倍。结论利用Ⅰ型胶原蛋白构建的3D支架材料可模拟骨髓微环境,促进红细胞分化。

透明质酸水凝胶三维培养促进人胚胎干细胞向红系细胞诱导分化

目的探讨采用透明质酸材料的三维培养方法将人胚胎干细胞(h ESCs)来源造血干/祖细胞向红系细胞诱导分化的效果。方法将hESCs与小鼠主动脉-性腺-中肾基质细胞(AGM-S3)共培养(37℃、5%CO_2)12 d的细胞(1.0×10~6)分别种植进海藻酸钠水凝胶、胶原蛋白水凝胶、透明质酸水凝胶内,并以悬浮法培养h ESCs作对照。以流式细胞仪检测细胞表面抗原表达,比较不同材料建立的三维培养的优劣,优化红系诱导分化的三维培养体系。结果海藻酸钠组内细胞培养10 d的GPA^+细胞为2.3%,GPA^+CD36+细胞仅为0.9%而悬浮培养分别为15.8%和6.1%。胶原蛋白组内细胞培养10 d的GPA^+细胞为11.1%,GPA^+CD36+细胞为5.2%,而悬浮培养分别为35.7%和27.7%。透明质酸组内红系细胞GPA^+细胞量和比率分别为2.06×105个和19.6%,而悬浮培养的红系细胞GPA^+细胞量和比率分别为1.62×10~5个和15.7%,透明质酸组是悬浮培养的1.27倍,其中悬浮培养GPA^+CD36-为9.7%,而透明质酸水凝胶为GPA^+CD36-为13.1%。结论与悬浮培养相比,海藻酸钠水凝胶和胶原蛋白水凝胶未表现出明显的扩增红系细胞的效果。透明质酸凝胶建立的三维培养方法利于红系细胞生长,该培养方法诱导分化hESCs得到的红系细胞成熟度提高。

拟胚体培养体系中造血表面标志的变化及其向红细胞分化潜能的研究

目的探讨拟胚体(EB)造血相关表面标志物的变化及其向红细胞定向诱导分化的潜能。方法利用悬浮培养体系使人胚胎干细胞(h ESCs)形成三维囊状结构(EB),通过添加细胞因子BMP-4、SCF和FL使EB向造血前体细胞分化,通过流式细胞术(FACs)检测细胞发育各个阶段内皮及血细胞表面分子的变化情况以判断细胞的不同发育阶段。采用胰酶消化处理的方式将EB消化为单个细胞并向红细胞诱导分化,在诱导的d7、d14、d21取样,流式检测分析红细胞的成熟程度。结果在EB培养体系中,d6即可检测到造血前体细胞表面标志物CD34和CD31,且在EB培养的d6-d21,CD34+CD31+细胞的比例逐渐升高,到d15达到顶峰(8.86%)。在红细胞定向分化过程中,红细胞的纯度达73.22%,免疫荧光染色显示:ε亚基的阳性率为88%(424/482),γ亚基的阳性率为94%(326/347),而β亚基的阳性率为0%(0/167)。结论建立了1种EB悬浮培养体系和体外诱导红细胞的方法;EB的造血相关表面标志物的表达呈现时序性变化,且由EB分化而来的红细胞具有早期胚胎红细胞的发育特点。

人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞促进成体造血发生研究

目的探讨人诱导性多能干细胞(hiPSCs)在神经分化因子作用下生成的间充质干细胞(N-MSCs)对成体造血的影响。方法 1)与神经发育相关的MSCs的获得:hiPSCs在向前脑类器官培养过程中分离纯化出1个性质稳定的细胞系,命名为N-MSCs,通过形态学观察、流式检测和脂肪、成骨、软骨细胞分化实验对其进行鉴定。2)N-MSCs对成体造血的影响:人胚胎干细胞(hESCs)与鼠AGM-S3细胞共培养获得的CD34^+细胞分别与AGM-S3、N-MSCs(2×10~4个)共培养,单独悬浮培养为对照组(CD34^+组,1×10~4个),流式检测关于造血干/祖细胞(CD34^+CD45^+)和巨噬细胞(Mφ)表面标记的变化。3)N-MSCs对人脐带血来源的巨噬细胞(CB-Mφ)的影响:Mφ分别与脐带MSCs(UC-MSCs)、N-MSCs(2.5×10~5个)在transwell中共培养,Mφ单独培养为对照组(5×10~5个),再用IL-4对Mφ做刺激试验。用MGG染色、流式检测、qRT-PCR等方法分析Mφ形态学、M2型Mφ相关表面标记CD206和IL-10基因表达情况。结果 CD34^+组及其分别与AGM-S3、N-MSCs 2个共培养组培养10 d时收获的CD34^+CD45^+细胞数量(×10~3个)分别为:0.44±0.045 vs 0.63±0.170 vs 2.93±0.190(P<0.01);Mφ数量(×10~4个)分别为1.70±0.046 vs 1.49±0.057 vs 2.46±0.086(P<0.05)。Mφ与UC-MSCs共培养组及与N-MSCs共培养组CB-Mφ的CD206占比(%)为56.1±1.15 vs 60.0±1.76(P<0.05)、IL-10的相对表达量为6.8±0.748 vs 8.10±0.804(P<0.01)。结论 N-MSCs能促进成体造血和CB-Mφ向M2型Mφ的转变。

P21基因参与早期诱导RUNX1b过表达抑制人类造血发生

目的探究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1[CDKN1A(P21)]对造血发生过程的影响。方法对RUNX1b诱导过表达hES细胞系(RUNX1b/hESC)与小鼠主动脉-性腺-中肾区(AGM)基质细胞AGM-S3共培养4 d细胞,使用多西环素(DOX)(1μg/mL)与RepSox(0.33μmol/L)或不同浓度DOX(1、0.5、0.2、0.1μg/mL)诱导RUNX1b过表达时,以qRT-PCR技术检测P21与RUNX1b相对表达情况。利用基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE真核诱导过表达系统,建立P21诱导过表达hES细胞系(CDKN1A/hESC)。分别在CDKN1A/hESC与AGM-S3共培养d0、d2、d4、d6添加DOX诱导P21过表达,培养8 d或14 d,通过流式细胞术(FACS)检测血细胞表面分子的变化情况,以判断诱导P21过表达对造血发生产生的影响。结果 qRT-PCR显示:P21表达量随着RUNX1b过表达上调,同时加入RepSox时表达基本处在正常水平,随着DOX浓度降低,RUNX1b与P21表达水平下降。在造血分化的早期,特别是共培养d0开始诱导P21过表达的共培养体系所产生的CD34^-CD43^+、CD34^-CD45^+与CD34^+CD45^+细胞群相较于对照分别降低了85%,94%和78%,当共培养d6后诱导P21过表达上述现象消失。结论 P21可能参与了由RUNX1b诱导过表达所引起的人类早期造血发生的抑制效应;早期诱导P21过表达明显抑制造血细胞产生。

未成熟CD71 +红细胞免疫功能研究进展

红细胞的主要功能是氧气运输,但其与机体免疫也存在密切关系。越来越多的证据表明不成熟的红细胞在疾病,特别是肿瘤的发展过程中,具有重要作用。本文就未成熟CD71+红细胞在生理和病理等状态下发挥的免疫调控作用研究进展作一综述。

人脑类器官来源间充质干细胞促进脐带血造血干祖细胞向巨噬细胞分化和功能极化

本文探讨了人脑类器官来源神经源性间充质干细胞(neural mesenchymal stem cells,nMSCs)对脐带血来源CD34(umbilical cord blood CD34,UCB-CD34)细胞向各系分化的作用,尤其是对巨噬细胞(macrophage,Mφ)诱导分化和极化的影响。本文通过UCB-CD34细胞与H1-nMSCs或hi PSC-nMSCs贴壁共培养,无MSCs组作为对照(control),计数共培养组和对照组造血细胞集落数、对集落细胞进行MGG染色、流式检测Mφ相关表面分子、转录组测序检测共培养7 d后CD34细胞红系和髓系基因表达的差异。将nMSCs通过trans-well与UCB-CD34来源的Mφ(UCB-Mφ)共培养,经IL-4刺激后,流式检测Mφ表面分子CD206的表达情况,并用U-PLEX平台测定培养基上清中IL-10的浓度。相较于对照组,UCB-CD34细胞分别与H1-nMSCs、hi PSC-nMSCs共培养时可获得更多的造血细胞集落(P<0.05)以及更多的M集落(P<0.01);UCB-CD34细胞分别与H1-nMSCs、hi PSC-nMSCs共培养第7天,可产生更多GMP细胞,而CFU-E产量减少。UCB-CD34细胞分别与H1-nMSCs、hi PSC-nMSCs在Mφ诱导分化培养基或无细胞因子分化培养基中共培养21 d后,均可获得更高比例和数量的Mφ。共培养7 d后CD34细胞转录组测序显示,与H1-nMSCs、hi PSC-nMSCs共培养组高表达GMP相关基因:NAPSB、HCK、FCGR1A、MS4A6A、PRTN3等和Mφ相关基因CD14、CSF1R、TRIB1和APP等;与nMSCs共培养组的UCB-Mφ在IL-4刺激时,高表达CD206表面标记分子,且分泌更多IL-10,即向M2型极化。本研究初步证明,H1-nMSCs、hi PSC-nMSCs能较好地促进UCB-CD34向Mφ分化及向M2型极化。

利用成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞株的研究

目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用CRISPR/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre已去除筛选标志物,为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示,打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时,荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光,FCM检测结果显示,未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比,造血干/祖细胞群比例相似,二者CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为12.4%和14.1%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为17.0%和20.2%,表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示,荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物,表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。结论本研究以GATA1为目的基因,在hPSC中快速、高效进行基因敲入,成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。