P19胚胎癌细胞体外定向心肌细胞分化模型的构建

目的：如何在体外将胚胎干细胞培育转化为大量的心肌细胞并进行移植,使之成为具有成熟心肌细胞功能？实验采用不同诱导剂对P19胚胎干细胞进行诱导,拟构建体外定向心肌细胞分化模型。方法：实验于2006-09/2007-03在日本东京工业大学生体分子机能工学研究室完成。①材料：P19细胞由日本东北大学加龄医学研究所提供。钙粘素融合蛋白N-cad-Fc由本研究室合成。②实验方法：P19细胞按1×10^7L^-1密度接种进行悬浮培养,分别以终浓度1,5,10,50,100nmol/L视黄酸及0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%二甲基亚砜各自诱导4d,将形成的细胞聚集体分别接种于预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc、10mg/LN-cad-Fc基质的24孔板中培养10d。③实验评估：观察不同诱导条件及不同基质上的细胞跳动情况,免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白TroponinT的表达,RT-PCR法检测心肌细胞标志性基因cardiacactin、gata-4的表达。结果：①P19细胞经1,5,10nmol/L视黄酸或0.5%、0.75%、1%二甲基亚砜诱导后,均出现可自主节律跳动的细胞。P19细胞聚集体悬浮培养至20d,预铺有0.1%明胶、2.5mg/LN-cad-Fc及10mg/LN-cad-Fc基质的培养板上节律跳动细胞团的出现率分别为44.6%、71.3%和70.1%。②药物诱导后,P19细胞心肌特异性蛋白TroponinT呈阳性表达。③与传统预铺有明胶的培养板比较,在预铺有N-cad-Fc的培养板上心肌标志性基因cardiacactin、gata-4的表达均明显升高,但10mg/LN-cad-Fc的表达量略低于2.5mg/LN-cad-Fc。④分别在上述不同基质上单层培养的P19细胞,二甲基亚砜诱导14d后均仍呈上皮样细胞形态,未见跳动细胞出现,RT-PCR检测无心肌标志性基因表达。结论：①使用0.5%～1%二甲基亚砜或1～10nmol/L视黄酸可成功诱导P19细胞心肌分化,心肌特异性蛋白TroponinT的表达早于心肌跳动的出现。②作为一种基质模型来模拟细胞间黏附,2.5mg/LN-cad-Fc是较适宜P19细胞心肌分化的条件。③P19细胞心肌分化有赖于药物诱导和细胞成团的共同作用,细胞间黏附分子对其分化有促进作用。

高机能肝细胞培养支架--海藻酸/半乳糖化壳聚糖海绵体的开发

重症肝功能衰竭是导致死亡的主要疾病之一。目前,肝移植是其唯一有效的临床治疗手段,但供体不足及伦理等问题,使不能及时得到治疗而死亡的患者正在逐年增多,随着组织工程学的发展,人们都寄希望于生物型人工肝脏。笔者正在研究开发三维立体肝细胞培养支架材料,探索体外肝组织再构筑技术和方法,实现高效生物型人工肝脏。笔者研究根据半乳糖残基与肝实质细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体的特异性结合作用,利用半乳糖残基化学改性天然高分子多糖壳聚糖,改善壳聚糖的肝实质细胞亲和性,并制成三维多孔海藻酸／半乳糖化壳聚糖海绵体肝细胞培养支架。从培养细胞形态学和肝功能等生化学分析角度考察了用该支架培养肝实质细胞的聚集体形成及肝功能等。

人E钙粘素融合蛋白基质对人骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导分化的影响研究

人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)源的肝细胞对于肝脏疾病的治疗和药物的开发具有巨大的应用潜力。利用基因工程技术构建了融合蛋白质粒,并通过真核细胞表达体系表达出了人E-钙粘素胞外域与免疫球蛋白Fc段的融合蛋白(hE-cadherin-Fc),并将其用于疏水材料的表面修饰仿生构建细胞-细胞间相互作用的细胞外微环境,检测其对hBMSCs向肝样细胞定向诱导分化的影响。诱导分化培养4周后,与组织培养板(TC-PS)、明胶(Gelatin)基质相比,hE-cadherin-Fc基质显著促进细胞表达ALB、CK18、HNF-4等肝细胞分化基因,并且细胞的糖原合成和吲哚青绿(ICG)摄取功能均显著提高。在hE-cadherin-Fc基质表面分化培养4周时,白蛋白和尿素合成的量为2.7pg/细胞/d和36.7 pg/细胞/d,相对于TC-PS和Gelatin分别提高了42.1%和28.6%、57.5%和25.7%。综上所述,利用hE-cadherin-Fc基质化构建细胞外微环境,有利于促进人骨髓间充质干细胞向功能化肝细胞的定向分化。

P19细胞心肌体外分化诱导条件的优化

目的 分别观察P19细胞心肌分化诱导中的几种影响因素，优化P19细胞心肌分化的诱导条件。方法使用悬滴法或96孔板悬浮培养法制备细胞聚集体（aggregates），二甲基亚砜（DMSO）为诱导剂诱导P19细胞的心肌分化。普通光学显微镜下观察跳动的心肌细胞的产生来确定诱导是否成功，免疫荧光染色确认心肌特异性蛋白Troponin T的表达，RT-PCR方法检测分化诱导后心肌细胞标志基因的表达情况。结果使用96孔板悬浮培养法诱导细胞形成聚集体后转入贴壁培养阶段时细胞聚集体贴壁状态优于传统的悬滴法。DMSO的加入可以提高细胞形成聚集体后贴壁时细胞聚集体的完整性。1×10^7～2×10^8L^-1的接种浓度下心肌细胞分化诱导效率较高。在可观察到跳动的心肌细胞之前即可检测到Troponin T的表达。结论通过对细胞形成聚集体的诱导方法、诱导剂、接种浓度等因素的优化可以提高P19细胞的心肌分化效率，为开发高效心肌分化诱导法提供了条件。

N-钙黏素融合蛋白抑制P19分化伴随的细胞凋亡

目的:讨论N-钙黏素融合蛋白N-cad-Fc对P19细胞分化过程中伴随的细胞凋亡的影响。方法:分子生物学技术制作N-钙黏素融合蛋白N-cad-Fc。视黄酸(retinoic acid,RA)诱导P19细胞分化,培养于明胶(gelatin)包被培养板上的P19细胞为对照组,普通光学显微镜观察其神经分化情况,TURNEL法和DNA片段化分析法检测细胞凋亡情况,alamarBlueTM染色法检测细胞存活情况。结果:培养于N-cad-Fc包被培养板上的P19细胞经RA诱导分化后细胞形态与明胶包被培养板上P19细胞分化形态一致,但分化过程中伴随的凋亡现象被明显抑制,分化诱导后细胞的存活率大大提高。结论:使用N-cad-Fc融合蛋白培养技术可以在不影响细胞分化状态的前提下降低分化过程中细胞的死亡率,为开发低死亡率的高效细胞分化诱导方法创造了条件。

N-钙黏素融合蛋白对P19细胞神经分化的影响

目的探讨细胞间黏附分子对胚胎癌P19细胞体外定向神经细胞分化的作用。方法通过单层培养技术，采用视黄酸为诱导剂诱导P19细胞神经细胞分化，在浓度分别为0．1％明胶、2．5mg／L和10mg／L的N-钙黏素融合蛋白（N-cad-Fc）包被的培养板上进行培养，观察细胞形态的变化情况，用神经细胞特异标志蛋白β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）抗体进行免疫荧光染色，反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测干细胞标志蛋白（oct3／4）、神经前体细胞标志蛋白巢蛋白（nestin）、神经元素1（ngn1）、微管相关蛋白（map2）和神经胶质细胞的特异性标志蛋白（gfap）的表达情况。结果使用5×10^-7mol／L的视黄酸成功诱导了P19细胞神经细胞分化，0．1％明胶组、2．5mg／L N—cad—Fc组和10mg／L N-cad-Fc组分化为神经元细胞的百分率分别为7．8％、28．6％和26．8％，在包被有N-cad-Fc的培养板上培养，神经标志性蛋白ngn1和map2的表达明显提前、增强，干细胞标志蛋白oct3／4表达提前减弱，未见神经胶质细胞的特异性标志蛋白gfap表达。结论视黄酸可以诱导P19细胞向神经细胞分化，细胞间黏附分子对分化有促进作用。