圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽（Verasper variegatus Temminck et Schlegel）和相关鱼类的部分线粒体基因序列，设计出6对扩增引物，通过PCR扩增产物直接测序和引物行走（Primer walking）法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列，并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp，其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同，包括37个基因（2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因）和2个非编码区（控制区和WANCY区）。在22个tRNA基因中，tRNA^Gln、tRNA^Ala、tRNA^Asn、tRNA^Cys、tRNA^Tyr、tRNA^Ser（第2个）、tRNA^Gln和tRNA^Pro的编码基因位于L链上，其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中，除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外，其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1，COⅠ，ATP8，ND4L，ND5，而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上，ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区（ETAS）、6个中央保守序列区（CSB-A、B、C、D、E、F）和3个保守序列区（CSB-1、2、3）以及长串联重复区（Tandemly repeat sequence）。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析，结果显示，圆斑星蝶与石鲽关系最近，鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的够科（Carangidae）、鲷科（Sparidae）鱼类亲缘关系较近，而同属于鲽形目的塞内加尔鳎（Solea senegalensis）没有和任何目聚在一起，成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank，登录号为DQ403797，控制区单元型序列的GenBank登录号为BQ834444～7。[中国水产科学，2007，14（4）：584—592]

文蛤养殖群体和野生群体遗传多样性的AFLP分析

应用AFLP标记技术对辽宁和山东沿海文蛤（Meretrix meretrix）养殖群体和野生群体的遗传多样性进行分析。采用7对AFLP引物组合对5个群体（3个野生群体，2个养殖群体）150个个体进行扩增，共得到364个的位点。5个群体内的多态位点比例为84．3945％～87．6465％，总多态位点比例为99．6300％。群体的Nei’s基因多样性指数（H）为0．2301～0．2634；群体的Shannon多样性指数为0．3617～0．4248，群体间的遗传距离为0．0394～0．1609，群体内个体间的遗传距离为0．2592～0．5360。辽宁大洼野生群体和山东河口野生群体的多态位点比例、Shannon多样性指数和群体内遗传距离均高于辽宁盘山和辽宁庄河养殖群体，辽宁庄河野生群体的遗传多样性处于中等水平。用UPGMA方法构建的群体系统进化树显示，辽宁庄河野生群体单独成为一支，辽宁大洼野生群体与庄河养殖群体聚到一起，辽宁盘山养殖群体与山东野生群体聚到一起，但是用这5个群体的150个个体进行的聚类结果显示，所有个体基本是随机交叉聚类，不能形成明显的类群分支。分子变异分析（AMOVA）表明，文蛤群体94．04%的变异来源于群体内，群体间的变异仅占5．96％。以上结果表明，文蛤群体内遗传多样性非常丰富，群体间相似性较大，且存在较强的基因交流。[中国水产科学，2008，15（2）：215-221]

圆斑星鲽及相关种类线粒体DNA控制区结构分析

采用PCR产物直接测序法测定了圆斑星鲽(Verasper variegatus)的24个个体的线粒体控制区(Control region)核苷酸全序列,并进行了结构分析。结果表明,圆斑星鲽线粒体控制区核苷酸全序列具有长度多态性,得到4种长度单元型,主要表现为控制区中的串联重复序列的长度不同。对鲽形目鱼类如鲽科的条斑星鲽(Verasper moseri)、黄盖鲽(Limanda feruginea)、马舌鲽(Reinhardtius hippoglossoides),美洲拟庸鲽(Heppoglossoides platessoides)和鲆科的牙鲆(Paralichthys olivaceus)以及鳎科的欧洲鳎(Soleasolea)、塞内加尔鳎(S. senegalensis)和沙鳎(S. lascari)的控制区的比较研究发现,鲽形目鱼类的线粒体控制区均存在相似的结构,即线粒体控制区可分为终止相关序列区(ETAS)、中央保守区(包括CSB-A、CSB-B、CSB-C、CSB-D、CSB-E、CSB-F)以及保守序列区(CSB1、CSB2、CSB3)和重复序列区(Repeat region)4个区域。通过与脊椎动物各个纲线粒体控制区序列的比较分析,发现只有鲽形目(包括鲆、鲽类和鳎类)鱼类和两栖纲的无尾类在CSB-3之后存在相似的串联重复序列。

鱼类CC趋化因子基因及其系统进化分析

CC趋化因子(CC Chemokine)是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。趋化因子也是当今国际鱼类分子免疫学研究的热点之一。本研究通过比较基因组学和生物信息学的方法,分析了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和斑点叉尾(Ictalurus punctatus)等重要经济鱼类的CC趋化因子基因结构特点和功能,并采用Clustal X的NJ法对所有新的CC趋化因子和先前发表的鱼类趋化因子与其他动物的CC趋化因子进行系统进化分析,建立了3个独特的包含非鱼类CC趋化因子的直向进化同源组。第1个直向进化同源组建立于人的CCL27和CCL28,有丽鱼科(Cichlidae)Melanochromisauratus和Paralabidochromis chilotes的SCYA101、SCYA101a、大西洋鲑(Salmo salar)的CB510320、斑马鱼(Danio rerio)的BI839410、虹鳟的CK11、斑点叉尾的BM027974和BM029630;第2个直向进化同源组是以人类CCL20建立的,包括虹鳟的CK8a、CK8b、斑点叉尾的SCYA112和鸡(Gallus gallus)AAK84434,其中鸡的序列与人的CCL20最相近(与其他鱼类CC趋化因子相比);第3个直向进化同源组是以鸡的XP_424980和蓝(Ictalurus furcatus)的SCYA109建立的。所有其他鱼类CC趋化因子都没有归类到非鱼类CC趋化因子的同源组中。为了进一步分析鱼类CC趋化因子和哺乳类CC趋化因子间的关系,采用Clustal W的非自举检验(Bootstrapping)启发式搜索(heuristic search)比对法对这些CC趋化因子进行归类分析,结果得到7个潜在的直向进化同源组,包括含有4个鱼类CC趋化因子的CCL20直向进化同源组、5个鱼类CC趋化因子的CCL24直向进化同源组、8个鱼类CC趋化因子的CCL22直向进化同源组、4个鱼类CC趋化因子的CCL17直向进化同源组、15个鱼类CC趋化因子的CCL25直向进化同源组,7个鱼类CC趋化因子的CCL27/CCL28和17个鱼类CC趋化因子的CCL19/CCL21直向进化同源组。趋化因子的研究将有助于更好地了解鱼类抗病性与天然免疫性的关系。[中国水产科学,2006,13(1):119-127]

斑点叉尾中国养殖群体遗传多样性的AFLP分析

采用AFLP分子遗传标记技术,对来自福建和湖北的1984年引进的斑点叉尾(Ictalurus punctatus)养殖群体(P1984)、来自福建和辽宁的1997年引进的养殖群体(P1997)、来自湖南的2004年引进的养殖群体(P2004)和来自湖北的1984年与1997年引进养殖群体的杂交群体(P8497)的遗传多样性进行研究。用10对选择性引物共扩增出523个位点,其中,243个位点为多态位点,多态位点比例为46.46%;没有发现可以用于区分4个群体的特异性位点,但找到一些潜在的群体鉴别片段;P1984、P1997、P2004和P8497群体的多态位点比例(P)分别为28.93%、38.90%、31.02%和41.66%,Shannon多样性指数(I)分别为0.1439、0.2081、0.1545和0.2373,平均杂合度(H)分别为0.0781、0.0949、0.0803和0.1137。群体间的遗传分化系数(Fst)值为0.1036;根据4个群体之间的基因分化系数(Gst)、遗传距离(D)、遗传相似度(S)以及UPGMA聚类分析发现,P2004和P1997亲缘关系最近,P2004和P1984亲缘关系最远。通过比较分析认为,4个养殖群体的遗传多样性水平均较低。

斑点叉尾鮰基因组的研究

作为重要的水产养殖种类之一,斑点叉尾(IctalurusPunctatus)的基因组学研究已经取得了较大进展。其众多遗传连锁图以及与表型性状有关的DNA分子标记和基因组资源已经建立;基因组中一些重要的重复片段,已经得到鉴定和辨别,这更有利于对斑点叉尾鮰基因组进行物理学分析;通过基因组学方法,获得了大量基因或全长cDNA序列、以及基因进化和与功能相关基因表达方面的信息。利用细菌人工染色体叠连群技术,创建斑点叉尾鮰基因组物理图谱,开发特定片段分子标记,进行数量性状基因位点(QTLs)分析和高密度基因组绘图。通过比较图谱,可以更有效地进行大范围EST分析和I型分子标记绘图。cDNA微阵列或基因芯片技术的利用,加快新基因发现和鉴定的步伐,为分子标记辅助育种和病害诊断与防治研究奠定了坚实基础。

虾夷扇贝脂多糖诱导的肿瘤坏死因子LITAF基因的克隆及表达分析

脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor,LITAF)是一类重要的炎症细胞因子,在先天性免疫系统中发挥重要的介质作用。文章根据虾夷扇贝LITAF基因EST序列,应用RACE技术克隆了虾夷扇贝LITAF全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,该基因cDNA全长1 551 bp,其5′非编码区包含76 bp,3′非编码区包含1 001 bp;开放阅读框(ORF)为474 bp,编码157个氨基酸,氨基酸序列中存在一个保守的LITAF结构域;理论分子量16.99 kDa,等电点为6.24。LITAF基因序列为3 698 bp,由3个外显子和两个内含子组成。利用实时荧光定量PCR技术分析LITAF在虾夷扇贝不同组织、不同胚胎发育阶段以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后各时间段的表达情况。结果表明:LITAF基因在所检测的6个成体组织中均有表达,其中肾脏的表达量最高;胚胎发育的7个时期中,担轮幼体时期表达量最高;菌刺激36 h实验组与对照组的表达量差异大。LITAF基因是LITAF家族的一员,推测LITAF基因参与虾夷扇贝的先天性免疫反应。

大连湾和辽东湾夏季海水细菌多样性16S rDNA分析

通过构建大连湾(DL17)和辽东湾(ZD-LDW 017)2个站点夏季海水的细菌16S rDNA文库,利用16S rDNA序列比对法,对大连湾和辽东湾夏季海水细菌多样性进行了分析。试验结果表明,这2个海域的细菌主要为非培养细菌。每个海区分别随机选取了200个克隆进行酶切谱型分析和序列测定,共得到104个不同的DNA序列,其中大连湾51个序列,分别属于13种(属);辽东湾53个序列,分别属于13种(属)。有6种菌为这2个海区所共有,这2个海区各自有不同的优势菌,且均未检测到致病菌,研究结果表明大连湾和辽东湾海水细菌具有丰富的多样性。

辽宁省水产种质基因库信息平台的构建与应用

针对辽宁省水产原良种场、海洋和淡水种质资源保护区、自然沿海海域及主要河流的重要水产经济物种,开发构建了生物种质信息库、DNA条形码数据库和分子标记信息库,并整合形成辽宁省水产种质基因库信息平台。平台涵盖重要水产经济物种150种,分子标记上万个,在水产物种种质鉴定、水产生物遗传多样性评价和水产种质资源保护区与原、良种场管理等方面具有较高的应用价值。本平台将推进水产种质保护和合理利用工作的深入开展,为水产科学工作者和生产者全面了解水产种质的特性,拓宽优势资源和遗传基因的使用范围提供数据保障。

斑点叉尾免疫相关基因及疾病防御

斑点叉尾（Ictalurus punctatus）,亦称沟鲶,为淡水温水性鱼类,天然分布于美国中部流域、加拿大南部以及大西洋沿岸部分地区。斑点叉尾是美国主要的淡水养殖种类之一,其产量超过美国淡水鱼总产量的一半以上[1]。该鱼食性杂。

辽东湾斑海豹遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP标记技术对辽东湾斑海豹的遗传多样性进行分析。采用7对AFLP引物对斑海豹3个群体(按不同采样年份分类)43个个体扩增共得到241个位点,3个群体内的多态位点比例为80.45%～95.85%,总多态位点比例为99.59%。群体的香农(Shannon)多样性指数为0.3817～0.4716,群体间的遗传距离在0.1742～0.4023之间。2007年群体的多态位点比例、Shannon多样性指数均高于2006年群体,2005年群体处于中等水平。用NTSYS软件进行个体聚类及UPGMA方法构建的群体系统树,发现3个群体的个体基本随机聚到一起,界限不十分明显,说明3年的群体差异不明显,甚至可以认为它们是混合群体。结果表明,斑海豹群体遗传多样性水平较低,遗传结构趋于简单化,且存在较强的基因交流。

内参基因在虾夷扇贝定量PCR中表达稳定性的比较

应用实时荧光定量技术,检测虾夷扇贝的β-actin、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogen-ase、α-tubulin、Cytochrome b5、TATA box binding protein-associated factor、Elongation factor 1α共6个内参基因在饥饿胁迫下各组织、致病菌感染前后和水环境升温前后不同时间段血样中的mRNA表达情况。经geNorm程序统计分析,6个内参基因在上述处理中的表达稳定性存在差异,导致不同处理中适用的内参基因有所不同。为进一步开展虾夷扇贝基因表达的定量研究奠定了基础。

硬骨鱼类线粒体基因系统发育信息效率分析

采用PCR产物直接测序法获得圆斑星鲽(Verasper variegatus)和条斑星鲽(V.moseri)线粒体基因组的全部基因序列,并从GenBank中下载已知分类地位相关鱼类的线粒体基因的核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列,用蛙、鸡、牛做外群,采用NJ和MP法,重建鱼类的系统发育树。通过计算各个基因在重建系统发育树时的准确率,估算该基因所含有的系统发育信息。结果表明,从氨基酸序列和核苷酸序列以及在目、科、属综合分析,这些基因的系统发育信息大致分为好(16SrRNA、ND2、ND4、12SrRNA、ND6、ND5)、中(Cytb、COII、COIII、ND1、COI)和差(ND3、ND4L、ATP6、ATP8)3个组。在目阶元,当用核苷酸序列分析时,12SrRNA、16SrRNA、COII、ND4、ND5和ND6最好,COI、COIII、Cytb、ND1和ND2为中等,而ND3、ATPase6、ATPase8和ND4L最差。当用氨基酸序列分析时,ND4和ND5最好,ND1、ND2、Cytb、ND6、COI、COII和ND4L为中等,ND3、ATPase6、COIII和ATPase8最差。在科阶元,当用核苷酸序列时,12SrRNA、16SrRNA、ND2和ND6系统发育信息最好;用氨基酸序列时,Cytb和ND2最好。在属阶元,所有基因的核苷酸序列都具有很好的系统发育信息,而COII、ND4L、ND1和ND3的氨基酸序列系统发育信息最差。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鱼类系统进化关系。

虾夷扇贝外套膜和肾脏组织cDNA文库构建以及EST的初步分析

利用SMARTcDNA文库构建试剂盒首次构建了健康虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)外套膜和肾脏2种组织的cDNA文库。2个文库容量分别为2.30×106CFU/mL和1.20×106CFU/mL,重组率均超过98%,平均插入片段长度均大于1kb,文库质量符合标准要求。将随机选取的4009个克隆进行5′端测序,得到3884个有效序列(外套膜923个,肾脏2961个),测序成功率96.9%。经过质量控制和拼接,共得到2007条单基因簇(Unigenes),包含363个序列重叠群(Contigs)和1644条单一序列(Singletons)。通过BLASTx和BLASTn搜索比对,共有659个Unigenes(外套膜157个;肾脏502个)获得了基因注释(E<e-5),占Unigene总数的32.84%。对Unigene的功能和分类进行了初步分析,发现多种与免疫相关的基因,如凝集素、超氧化物歧化酶、溶菌酶、大防卫素等。利用SSRIT在线工具对2007条Unigene查找微卫星,发现有69个EST中含有微卫星序列,其中40个可以用于引物设计。虾夷扇贝cDNA文库的成功构建,为进一步的EST分析、功能基因的表达和克隆、多态性EST-SSR的筛选以及虾夷扇贝分子遗传学研究、种质资源评价和分子选育等奠定了基础。

工厂化养殖仿刺参营养品质分析与评价

为了更好地了解工厂化养殖仿刺参的营养成分和品质,本研究采用国标等方法,分别对工厂化养殖、池塘养殖、底播自然生长和海捕野生仿刺参的各项营养成分进行了分析和评价。结果显示,工厂化养殖仿刺参出皮率为62.7%～65.8%,煮后出皮率为24.8%～31.1%,显著高于其他来源仿刺参。工厂化养殖仿刺参的必需氨基酸/非必需氨基酸为0.46～0.50,氨基酸营养价值平均得分为87.89～90.42,均高于其他来源仿刺参,说明其氨基酸营养价值水平较高。在其他营养成分方面,工厂化养殖仿刺参与池塘养殖仿刺参较为相近。自然环境生长仿刺参由于摄食来源广泛、生长周期较长,其蛋白质与脂肪水平普遍高于其他来源仿刺参。综合分析认为,工厂化养殖仿刺参的营养价值与池塘养殖仿刺参相近,在出皮率和氨基酸营养水平上优于池塘养殖和自然环境生长仿刺参,说明工厂化养殖仿刺参具有较好的品质和营养价值。

影响仿刺参生长的主要因子研究进展

仿刺参（Apostichopus japonicus）主要分布于山东半岛和辽东半岛,在中国20多种食用海参中质量最好[1-3],被列为我国海产“八珍”之一,有“海中人参”之美誉[4]。随着人民生活水平的提高和对营养健康食品的关注,仿刺参的消费市场不断扩大。

虾夷扇贝遗传连锁图谱的初步构建

用AFLP标记首次构建了虾夷扇贝遗传连锁图谱。用56对引物组合对父母本和52个F1代个体进行遗传连锁分析,共得到1855个标记,其中多态位点为598(32.2%)个,而354个符合孟德尔1:1分离比。用这些标记和23个偏分离标记(0.01<P<0.05)构建的虾夷扇贝遗传连锁图谱中,雄性连锁图谱包括178个标记,分布在22个连锁群上,总长度1263.0cM,标记平均间隔为8.1cM,图谱覆盖率为79.3%。雌性连锁图谱包括163个标记,22个连锁群,标记平均间隔为8.9cM,总长度1259.5cM,覆盖率为76.8%。标记在连锁群上分布不均匀并且出现大量0重组率标记。

双壳贝类线粒体基因组结构的比较

利用比较基因组学和生物信息学方法,比较分析了已登录到GenBank中的14种海产双壳贝类和2种淡水双壳贝类的线粒体基因组的结构特征。结果发现,双壳贝类线粒体的基因组结构、基因排列顺序均互不相同;不同目、科和属之间线粒体基因组的大小、基因排列方式以及基因种类也存在明显的差异,尤其是基因排列方式没有明显的规律。对16种双壳贝类的线粒体基因组全序列、编码基因序列进行系统分析,分别得到了不同的聚类结果,即用基因组全序列聚类时,16种贝类的聚类结果与传统的形态学分类地位基本相同;而将16种贝类的所有蛋白质编码基因和2个rRNA基因按照一致顺序排列起来进行聚类时,所得的系统分类情况与这些贝类传统的形态学分类地位相差较大。

辽东湾斑海豹线粒体ND4、tRNA^(Arg)、ND4L和ND3基因序列分析

用PCR产物直接测序法,测定渤海辽东湾斑海豹15个个体线粒体的一段从ND3到ND4基因长度为625 bp的DNA序列。其中的1~118 bp是ND3基因的后部分,120~188 bp是tRNAArg基因完整序列,189~485 bp是ND4L基因完整序列,479~625 bp是ND4基因的前部分。在ND4L和ND4之间,有7个碱基是重叠编码的。15个序列间,只有ND4L基因中有一个位点发生C/T碱基转换。与GenBank中的斑海豹序列比较,tRNAArg基因序列完全一致,而ND4L基因序列则有两处发生转换。利用从GenBank中下载的22个海豹科动物的ND4L基因序列的系统发生分析表明,海豹科动物分为南半球和北半球两大类群,斑海豹与港海豹为北半球种类,亲缘关系最近。