信号标签诱导技术的研究进展

Signature-tagged mutagenesis(STM)信号标签突变技术是一种有效的负向选择方法,主要用来鉴定能使病原体在宿主体内成功存活和复制的决定性基因。问世十几年以来,STM技术已经应用于31种细菌中,筛选了大量的转座插入突变体,有大约1700多种细菌的基因得到认识和鉴定,包括毒力因子。由于在信号标签和鉴定方法的改进,使得STM技术有了很大发展,增加其多样性和灵活性,扩大了其应用范围。本文就STM技术中关键步骤的改进进行综述。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型信号标签诱导突变体库的构建

本研究以自杀性质粒pUT携带含有信号标签的Mini-Tn5转座子对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌进行转座诱变,构建了带有12对特异性信号标签的Mini-Tn5转座子的pUT自杀质粒,转化到供体菌E.coliβ2155后,利用双亲本滤膜杂交法与受体猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌(APP1)进行接合转移,构建并优化了接合转移体系。利用抗性和营养缺陷培养平板筛选得到接合突变体,通过抗性通用引物与12个特异标签引物和胸膜肺炎放线杆菌毒素IV(ApxIV)鉴定引物分别对这些突变体进行了PCR鉴定和测序验证。结果表明,经过加入标签的Mini-Tn5转座子可以通过接合转移的方式从供体菌E.coliβ2155中插入到APP1基因组当中,并成功构建了12个含有特异信号标签的重组质粒,获得了APP1的12个转座突变体库,经筛选鉴定后得到561个突变株。这为研究APP1的功能基因和筛选特定突变株提供了必要的基础。

禽致病性大肠杆菌生物被膜的形成及其影响因素

为确定影响细菌生物被膜(BF)的形成条件,本研究采用BF体外定性观察和定量粘附性检测两种方法对1株野生禽致病性大肠杆菌(E.coli)在不同环境(培养时间、培养基类型、引导载体类型、营养条件)下产生BF的差异进行了研究。结果显示野生禽致病性E.coli其宿主体外BF最适形成条件是培养时间为48h,培养基为5%TSB、引导载体为平底96孔聚苯乙烯微孔板(美国Corning Costar)。其生长周期为8h时开始起始粘附、24h形成若干微菌落、36h微菌落粘连、48h形成完整的BF、72h细菌脱落开始下一轮的BF生长。糖分和适量的无机盐都可以在一定程度上促进BF的形成和被膜内细菌的粘附性提高。该研究表明禽致病性E.coliBF的形成周期,并为抑制其形成提供了实验依据。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌“菌影”的制备

本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。再将含有E基因的裂解盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中,构建胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒。采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌中,含有打孔质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,升温42℃诱导E基因的表达,制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影。电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。本试验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂奠定了基础。

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌（APP）体内表达的基因进行了初步筛选。将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合．分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21（DE3）的全菌及全菌裂解物进行吸附。用ELISA方法检测吸附效果，经吸附后血清D150nm分别由原来的0．927和0．239降低为0．196和0．078。同时,将APP1基因组DNA以Bsp143I进行酶切，回收500～2000bp的片段，与pET30a／b／c载体连接，构建了APP1基因组质粒表达文库，库容量（CFU）为2．0×10^5。用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库，从3000个菌落中获得了12个阳性克隆。

大肠杆菌“菌影”的制备

通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将该基因连接到含有PR/cI启动阻遏系统的pBV220载体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建溶菌质粒pBV-E。采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),含有裂解质粒的大肠杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,然后升温到42℃诱导其溶解,制成了大肠杆菌菌影。电镜观察发现菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术(SOE-PCR)获得了融合基因22-ag85B,将基因连接于表达载体pET32a(+),构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,以IPTG(终浓度1mmol/L)诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。

牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA的原核表达及免疫活性分析

为验证牛分枝杆菌外膜蛋白A是否具有免疫活性,以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA,采用DNA重组技术将此基因片段连于表达载体pGEX6p-1,构建重组质粒pGEX6p-1-ompA,并将其转化到大肠杆菌中BL21(DE3)中,IPTG诱导(终浓度为0.1mmol/L),表达产物进行SDS-PAGE分析。用glutathione sepharose4B纯化蛋白和Western blot分析该蛋白的免疫学活性。结果表明:pGEX6p-1-ompA以可溶形式表达,蛋白分子量大小为60kDa,与预计大小相符,纯化的蛋白具有良好的免疫学活性。

胎儿弯杆菌表面蛋白SapA抗原单克隆抗体的制备

用原核表达的重组胎儿弯杆菌毒力因子表面蛋白(rSapA-N)免疫小鼠,采用细胞融合技术,共获得2株抗rSapA-N的单克隆抗体(MAb),经Ig亚类鉴定,均为IgG1,轻链为κ链;Western blot证实这2株MAb均能与rSapA-N发生特异性反应,而与其它蛋白则不发生反应;以这2株MAb的杂交瘤细胞制备腹水,效价达到1∶100 000和1∶60 000。本研究制备的MAb,为研究和检测胎儿弯杆菌提供了一种重要的手段。

哈尔滨市鲜肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解哈尔滨市单核细胞增生性李斯特菌(Lm)的污染状况及耐药状况。在哈尔滨市市场随机采集158份鲜肉样品,采用显色培养基分离,API试剂条和PCR鉴定等方法对样品中的Lm进行分离鉴定,并通过Kirby-Barer法测定分离菌株对24种抗生素的耐药性。结果从鲜肉中共分离到Lm23株,检出率为14.56%,其中鲜猪肉检出率最高,达20.00%(14/70);23株分离菌株中耐药菌株为22株,耐药率高达95.65%。这表明哈尔滨市鲜肉中存在一定程度的Lm污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象。应加强控制动物饲料亚治疗抗生素的使用并严格遵守休药期,防止耐药菌株产生进而控制食源性疾病的发生。

畜炎宁治疗奶牛子宫内膜炎疗效试验

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后主要由于细菌感染而引起的常见产科慢性、常发性疾病,给奶牛养殖业造成很大的经济损失。采集患子宫内膜炎奶牛产后阴道分泌物进行细菌分离鉴定和药敏试验,了解子宫内膜炎病例中病原菌的种类及耐药情况。在临床试验中,选用海正畜炎宁与野菊花、金银花、蒲公英等为主要成分的中草药进行对比疗效试验,通过治疗前后子宫及阴道恢复情况来确定治疗效果。试验结果证实:该牛场引起子宫内膜炎的细菌主要是以大肠杆菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢菌、链球菌和枯草芽孢杆菌为主,单一感染所占比例为24.4%,混合感染所占比例为75.6%;药敏试验结果表明海正畜炎宁最为敏感,临床试验也证实:肌肉注射畜炎宁组有效率最高,达到78.75%;子宫灌注畜炎宁组达到75%;而对照组子宫灌注组仅为50%,因此,在治疗牛子宫内膜炎时,海正畜炎宁可作为治疗药物的首选。

重组猪α干扰素防治猪腹泻

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,是临床上导致猪腹泻的重要病毒。该病不同年龄、性别和品种的猪均易感,其中仔猪的感染率、发病率、死亡率最高,其临床症状主要为腹泻、呕吐和脱水。防控猪流行性腹泻主要采取切断传染源,加强饲养管理和环境消毒等措施。干扰素具有广谱抗肿瘤、抗病毒的免疫调节性细胞因子,其在先天性免疫和获得性免疫中都起着重要的作用。研究发现重组α干扰素对猪口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等有抗病毒活性。

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果表明,成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。表明pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质。

利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。