山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒PmeⅠ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒AdINSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-1)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P<0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降(P<0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P<0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。

催乳激素对山羊脂肪酸合酶基因转录活性的影响

为探讨催乳激素对体外培养的山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)基因转录活性的调控作用,试验分别用不同浓度的胰岛素(insulin,INS)、雌激素(estradiol,E_2)、催乳素(prolactin,PRL)及不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理山羊乳腺上皮细胞24h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测催乳激素对FASN基因mRNA表达水平的影响。细胞转染山羊FASN基因启动子报告基因载体,同样用不同浓度的胰岛素、雌激素、催乳素及激素组合处理24h,利用双荧光素酶报告基因系统检测催乳激素对FASN基因启动子活性的影响。结果发现,用雌激素、催乳素处理山羊乳腺上皮细胞后,FASN基因启动子活性及mRNA水平极显著或显著上调(P<0.01;P<0.05),雌激素浓度为10、100μmol/L和催乳素浓度为0.1和1μg/mL时效果最为明显,而胰岛素对FASN基因的启动子活性及mRNA水平没有显著影响(P>0.05)。用不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理细胞均能显著上调FASN基因启动子活性及mRNA表达水平(P<0.05)。结果表明,雌激素和催乳素能够调控FASN基因的转录活性,为进一步研究泌乳过程中FASN基因的分子调控机制提供理论依据。

SIRT1/FoxO1通路对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成的影响

为研究SIRT1/FoxO1通路在奶山羊乳腺脂质合成中的作用,本实验采用0(对照)、50、100、150μmol/L的SIRT1激动剂(RES)处理奶山羊乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测脂质代谢相关基因的表达,检测细胞中甘油三酯含量,油红O染色法观察脂滴的积累情况。结果表明:100μmol/L RES处理组的SIRT1和FoxO1基因的相对mRNA表达量高于对照组(P<0.05),乳脂关键调控因子SREBP1和PPARγ表达量下降(P<0.05);SIRT1/FoxO1通路激活后,脂肪酸合酶FASN(P<0.01)、脂肪酸去饱和酶SCD1(P<0.01)和脂肪酸转运酶CD36(P<0.05)表达量均下降;而脂解相关基因HSL和ATGL的表达上调(P<0.05)。SIRT1/FoxO1激活后,细胞中甘油三酯含量显著降低(P<0.05),脂滴积累减少。综上可知,SIRT1/FoxO1通路负调控奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成,为改善羊奶营养价值和风味提供基础资料。