miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

血管活性肠肽在中国黄羽鹌鹑法氏囊中的定位

本文采用免疫组化SABC法和显微图像分析技术对不同周龄中国黄羽鹌鹑法氏囊中VIP进行组织学定位,观察在不同生长阶段VIP的分布规律及形态特征。结果显示,VIP在新生雏和1、3、5、9、13、17、21、23、25、32、36周龄中国黄羽鹌鹑法氏囊中广泛存在,多呈长梭形、马蹄形、椭圆形、团块状或细小颗粒状,主要分布在黏膜下层、肌层、浆膜,其中以3周龄的分布最为典型。到25周龄时VIP阳性反应的平均光密度值达到最大,随后逐渐减弱。结果表明,VIP存在于各生长阶段的中国黄羽鹌鹑法氏囊中,其分布规律与法氏囊的发育及功能变化有一定的相关性。

丙烯酸酯接枝环氧树脂的制备与其接枝率的测定

采用甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸羟丙酯混合单体通过自由基聚合制备了聚丙烯酸酯树脂,通过接枝共聚反应合成制备了丙烯酸酯接枝环氧树脂,并利用红外光谱、核磁共振13C-NMR谱对其结构进行了表征,详细探讨了采用甲醇热溶冷析分离方法测定丙烯酸酯接枝环氧树脂的接枝率的可行性,研究结果表明:采用甲醇热溶冷析分离方法可以比较精确地测定所合成制备的丙烯酸酯接枝环氧树脂的接枝率;在丙烯酸酯接枝环氧树脂共聚反应中,随着单体用量的增加,丙烯酸酯接枝环氧树脂的接枝率增大,但单体反应率下降。

单片机与PC机双机串行通信简明实例

串行通信是PC机与单片机之间常用的通信手段之一,利用Visual Basic 6.0的MSComm串行通信控件设计通信程序,并将RS-232串行端口作为与PC机通信的渠道,可以实现PC机与单片机之间的串行通信.

浅谈高职网页设计与制作授课技巧

网页设计与制作是大多数高职院校学生必须掌握的一项技能,在全方位培养人才中起着非常重要的作用。但对于一个新手,既想节约时间,又希望能够在网络上证明自己,做出有创意的网页,是比较困难的一件事。因此,有必要研究网页设计与制作的技巧。合理设置内容、明确教学目标、创新教学方法、构建授课框架和改革考评方法是高职网页设计与制作的有效方法。

piRNAs在法医学体液鉴定中的能力评估

本文探究9个非编码Piwi-interacting RNA(piRNA)分子在法医常见体液中的表达差异,利用统计学方法评估靶标分子的体液区分能力,为法医学中常见体液(斑)鉴定提供方法补充。研究收集120份法医常见的人源体液样本(包括外周血、月经血、精液、唾液和阴道分泌液),采用实时荧光定量PCR法检测5种体液中靶标piRNAs分子的表达,并用Genorm、NormFinder、BestKeeper软件和ΔCt四种方法评估3种内参的稳定性,分析其在各体液中的相对表达量ΔCq的差异性,筛选出9个可用于体液区分的标记分子。针对当前法医唾液和阴道分泌液区分的难点问题,本研究利用多分子组合建立支持向量机分类模型(support vector machine,SVM)实现唾液和阴道分泌液的鉴定。此外,通过检测模拟案件样本中piRNAs的相对表达量变化评估该类小分子的稳定性。本研究筛选出9个可用于体液斑迹鉴定的标记分子,利用其中3个piRNAs分子piR-33151、piR-31662、piR-31925组合,建立起SVM分类模型可用于唾液和阴道分泌液的有效鉴别,准确性可达100%。3个分子在室内晾干12个月或紫外照射48 h的样本中仍可检测出。本研究结果表明:piRNAs分子在不同体液中的相对表达具有显著性差异,具有鉴别法医学中常见体液类型的能力,建立的分类模型可高效准确地区分唾液、阴道分泌液,具有较大的应用潜力。

mRNA分析在体液斑迹组织来源推断中的应用研究进展

mRNA因其自身的不稳定性和易被降解的特性而一直被法医学研究所忽略。然而,终点逆转录PCR、实时荧光定量PCR、转录组分析等分子生物学技术的进步打破了这些关于mRNA的传统认知,为mRNA分析的法医学应用奠定了基础。目前,基于mRNA分析的体液斑迹组织来源的推断已有主流方法,就是构建复合检测体系检测不同体液中特异性mRNA分子的表达。2011年至今,欧洲DNA分型工作组(EDNAP)组织了6次联合试验,评估了mRNA分析在体液鉴定中的有效性和可重复性。本文主要概述mRNA分析技术在体液斑迹组织来源推断中的研究进展及应用。

MicroRNA分析技术在同卵双生子甄别中的可行性分析

同卵双生子具有相同的基因组DNA序列,因而无法使用常规的DNA分型方法如短串联重复序列即STR分析对其作鉴别区分。故破获涉及同卵双生子的案件有非常大的挑战性,因此在法医物证学领域迫切需要新的技术方法来应对并解决这一难题。随着表观遗传学的发展,转录组学成为法医学研究的新切入点。MicroRNA(miRNA)作为一类内源性的非编码小RNA分子,在机体中参与调节多种生理学过程,是转录组学研究的重要对象。研究表明,miRNA具有高保守性、分子量小、表达时序性及组织特异性强等特点,表现出法医物证应用方面的巨大潜力。本文综合分析了miRNA检测技术在同卵双生子甄别中的应用可行性,并综述了近年来miRNA在同卵双生子甄别上的研究进展。

一种复合miRNAs检测体系的构建及在体液组织属性来源鉴定中的应用研究

目的选取5种常见体液的10条特异性miRNAs基因,通过逆转录-终点法PCR技术构建复合扩增体系,并对体系的灵敏度进行测试,之后使用该体系检测静脉血、精液、月经血、唾液和阴道分泌液中miRNAs的表达情况。方法首先设计10条miRNAs标记的逆转录引物和cDNA扩增引物,构建10个标准miRNAs标记的荧光复合体系,并进行灵敏度测试。然后使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取体液样本的RNA,运用荧光复合体系进行检测,并对检测结果进行分析。结果本研究得到10个标准miRNAs标记的分型结果,标准miRNAs标记的荧光复合体系的检测灵敏度为总miRNAs模板量≥1ng。静脉血样本10条miRNA检测结果:miR-451、miR-144-3p、miR-144-5p,峰值在3000~7000 rfu之间;月经血样本分型结果:miR-214、miR-451、miR-144-3p、miR-205-5p、miR-203-3p,峰值在800~7000 rfu之间;阴道分泌物样本分型结果:miR-144-3p、miR-203-3p,miR-205-5p,峰值在600~3000 rfu之间。唾液样本分型结果:miR-451、miR-144-3p、miR-205-5p、miR-203-3p,峰值在600~7000 rfu之间;精液样本分型结果:miR-888、miR-144-3p、miR-891a,峰值在1000~7000 rfu之间。结论本研究建立的该体系能够对5种法医学常见体液(静脉血、唾液、精液、月经血和阴道分泌物)进行区分鉴定,为犯罪现场体液斑痕鉴定提供了新的检测方法。

残留基因组对miRNA检测的影响评估

目的研究判断常规试剂盒所提RNA中残留的基因组是否会对后续RNA检测产生影响并建立相应的纯化应对策略。方法使用miRNeasy?Mini Kit提取外周血和月经血样本中的RNA,用TURBO DNA-free?Kit对部分RNA纯化,通过紫外荧光定量、琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量检测等方法对比纯化前后是否存在显著差异性,并使用琼脂糖凝胶电泳以及毛细管电泳DNA分型扩增来判断外周血样本中提取的RNA是否有基因组残留。结果使用试剂盒进行DNA纯化后可有效去除残留的基因组DNA。纯化后的RNA浓度较纯化前大都有所下降;琼脂糖电泳结果显示纯化后无DNA条带,RNA条带纯化前后差异不大,完整性良好;RNA实时荧光定量检测结果显示单个microRNA(miRNA)在纯化前后有些会存在总量上的差异,但6种miRNA在外周血和月经血中相对表达量高低始终保持一致。结论常规RNA提取试剂盒所提RNA中含有的DNA会影响部分miRNA检测结果,但不会影响对体液组织属性来源的判定。对提取的RNA进一步纯化可有效去除基因组DNA残留,但同时会影响RNA总量。要根据实际研究需要,决定是否应该予以纯化。

基于microRNA表达量及判别分析的外周血与月经血鉴别

目的根据2种血液类体液(外周血和月经血)和3种非血液类体液(唾液、精液、阴道分泌液)中多种微RNA(microRNA,miRNA)差异表达的特征构建判别分析模型,形成外周血与月经血的鉴别方案。方法从文献中筛选出6种miRNA(miR-451a、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-214-3p、miR-203-3p和miR-205-5p),收集5种法医学常见体液样本(外周血、月经血、唾液、精液和阴道分泌液),并将样本划分为训练集及测试集,采用SYBR Green荧光实时定量PCR技术检测,基于训练集的表达量数据构建判别分析模型,另外采用测试集的表达量数据检验该模型的准确度。结果成功构建了可同时区分血液与非血液类样本以及区分外周血与月经血样本的判别分析统计模型,模型的鉴别准确率达99%以上。结论本研究为外周血和月经血样本的法医学体液鉴别提供了科学准确的鉴别策略,有望在法医学实践中应用。

基于使用功能的村镇公园景观设计探讨--以广州市国学文化公园为例

介绍了广州市国学文化公园的景观设计,分析了其在使用功能方面存在的主要问题,通过对公园使用功能的内容和设施情况进行基础调研,提出了完善村镇公园使用功能设计上的理论及策略,以打造真正属于村镇居民的村镇公园。并为广州市村镇公园的景观设计提供一定的参考价值。

miR-888和miR-891a的双重微滴式数字PCR检测在精液鉴定中的应用

目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系,并评估其在精液鉴定中的应用价值。方法 通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测,对5种体液(外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液)共75份样本进行检测,采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析,通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值。结果 该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义,检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA,批内与批间变异系数均小于15%。经双重ddPCR检测,精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液。经ROC曲线分析,miR-888的AUC为0.976,最佳截断值为2.250 copies/μL,判别正确率为97.33%;miR-891a的AUC为1.000,最佳截断值为1.100copies/μL,判别正确率为100%。结论 本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法,体系的稳定性和重复性良好,可用于精液鉴定,miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力,且miR-891a的判别正确率更高。

一种基于数字PCR技术的精液鉴定方法

本文建立双重数字PCR检测miR-891a-5p和内参基因RNU6b鉴定精液的方法,并评估其对实际案件的检验能力。通过设计5’端不同荧光修饰的TaqMan MGB探针,建立检测miR-891a-5p和RNU6b的双重数字PCR方法,对5种体液(包括精液、外周血、月经血、唾液、阴道分泌液)共107份样本进行检测,以非参数检验和ROC曲线分析评价所建方法鉴别精液的能力;进行灵敏度试验并制备不同比例的混合斑、模拟降解精斑等测试体系的准确性。结果表明,精液miR-891a-5p表达水平显著高于其他体液(P<0.0001),其与内参基因RNU6b的表达情况证实方法能够实现100%的精液鉴定。所有测试条件下的样本(包括0.008μL的微量精液、按1︰100与其他4种体液混合的精斑以及室外放置14 d、紫外照射24 h或洗涤过的精斑等)均被正确鉴别。本研究成功建立了一种基于数字PCR技术准确、灵敏地鉴定精液的方法,显示出良好的鉴别能力和应用前景,可在法医实际检案中广泛应用。

基于微生物标记物鉴别唾液、阴道分泌物的多重荧光标记复合扩增检测体系构建

目的构建基于微生物标记物的荧光复合检测体系,实现对唾液斑迹、阴道分泌物斑迹的区分鉴别。方法经文献检索结合本实验室前期工作,根据特异性和丰度筛选唾液和阴道分泌物微生物标记物;制备唾液斑迹、阴道分泌物斑迹样本,提取总DNA,利用毛细管电泳技术构建基于微生物标记物鉴别唾液、阴道分泌物的多重荧光标记复合扩增检测体系,并使用体液斑迹样本对体系特异性、灵敏度进行检验。结果本研究筛选出5个唾液微生物标记物(微黄奈瑟氏菌Neisseria subflava、非典型韦荣氏菌Veillonella atypica、唾液链球菌Streptococcus salivarius、口腔链球菌Streptococcus oralis、凯托卟啉单胞菌Porphyromonas catoniae)和3个阴道分泌物微生物标记物(卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus、加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri、短双歧杆菌Bifidobacterium breve),利用毛细管电泳技术构建了8重微生物荧光标记复合扩增检测体系,并使用140份样本对体系特异性进行验证;测试结果显示,唾液和阴道分泌物的微生物标记物特异性良好。体系对唾液斑迹检测灵敏度为0.065 ng总DNA,对阴道分泌物斑迹检测灵敏度为0.125 ng总DNA。本体系检测过程中提取的总DNA能够同时满足法医DNA检验中通过常染色体短串联重复序列分型进行个体识别的需求。结论本研究构建的8重微生物荧光标记复合扩增检测体系可以实现唾液和阴道分泌物斑迹样本的有效区分,为犯罪现场体液斑迹组织属性推断鉴定技术方法开发提供了新思路。

微生物多样性分析在体液组织来源鉴定中的研究进展

研究表明人体不同的身体部位有独特的微生物群落,且在身体各部位发现的微生物总量比人体自身细胞更多,因此基于人体微生物群落组成的时空分布特点和变化规律来进行体液组织来源推断是一个重要的应用方向。本文综述了人体微生物多样性分析应用于法医学体液组织来源鉴定的背景、研究技术、近年来的研究进展及应用挑战,以期为相关研究和实践提供参考。

不同种类RNA作为TSD推断内参基因的研究筛选和评估

目的准确估算血迹离体时间能为刑事案件调查提供信息或线索。本文利用qPCR技术检测血迹中RNA的降解情况,进而筛选并评估适用于血迹离体时间推断的内参基因(reference genes)。方法本研究制备10名志愿者0~90 d区间范围内7个时间节点共70份样本的总RNA为实验材料,基于其中6名志愿者的样本的qPCR数据,使用geNorm和NormFinder算法对14个候选内参基因(let-7g-5p,let-7i-5p,miR-191-5p,miR-484,miR-103a-5p,miR-423-5p,PPIA,ACTB,5SrRNA,18SrRNA,miR-93-5p,U6b,SNORD24,SNORD38B)进行稳定性评估,筛选内参基因及其使用方案。选取全部10名志愿者70份样本,验证内参基因及其使用方案的校正效果。结果qPCR检测显示miRNA在血迹离体后90 d范围内表现出的稳定性较强。综合使用geNorm和NormFinder两种算法获得的内参基因使用方案为:以let-7g-5p为单基因内参,或以let-7g-5p、U6b和miR-191-5p组合为三内参基因。70个样本对两个内参基因使用方案的校正能力验证显示,多基因组合内参方案的三次方程模型能更准确推断血液斑迹的离体时间。结论本研究首先推荐以ACTB为标记,以let-7g-5p、U6b、miR-191-5p组合的三内参基因三次方程校正模型用于血迹离体时间推断检验鉴定技术研发;在考虑提高检验效率、简化实验流程等需求而需要选择单基因作为内参基因时,可以选择ACTB为标记,使用let-7g-5p为内参基因的三次方校正模型。

基于RNA生物标志物的血痕形成时间推断模型构建与验证

目的 筛选血痕中与其形成时间(time since deposition,TSD)具有相关性的RNA生物标志物并构建血痕形成时间推断模型。方法 从文献筛选12个候选RNA生物标志物(ALAS2、B2M、HBA、HBB、PPIA、ACTB、GAPDH、SPTB、SNORD24、SNORD38B、5S rRNA、18S rRNA),以let-7g-5p为内参基因,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qRCR)技术检测10名健康无关个体在7个时间节点的70份血痕样本,候选RNA生物标志物在0~180 d范围内的相对表达丰度,筛选与形成时间相关性高的RNA生物标志物,以此构建用于血痕形成时间推断的多元线性回归模型并验证。结果 通过GraphPad Prism和SPSS Statistic 22软件对候选RNA生物标志物的?Cq值(?Cq=Cq_(生物标志物)–Cq_(let-7g-5p))进行正态分布分析和相关性分析,确认PPIA、ACTB、GAPDH、ALAS2、B2M、HBA、18S rRNA和HBB这8个RNA生物标志物与血痕形成时间具有相关性。根据模型构建需要,选择向后回归法分别基于8个、4个、2个RNA生物标志物构建血痕形成时间推断多元线性回归模型,通过留一法对模型进行验证,选取实验样本和案件样本对模型推断效果进行测试,确定模型平均绝对偏差(Mean absolute deviation,MAD)。结论 本研究构建和验证了用于血痕形成时间推断的基于多个RNA生物标志物的多元线性回归模型,并使用案件样本进行了测试,评估了模型的实战应用潜力。