重组Ⅲ型人源化胶原蛋白关键质量参数分析方法建立

目的针对重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的关键质量参数进行检测方法研究。方法采用基质辅助激光解吸/飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及尺寸排阻色谱与多角度光散射联用(size exclusion chromatography with multi-angle light scattering,SEC-MALS)法测定相对分子质量及其分布;采用毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;采用离子交换法和毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)分离分析电荷异构体;采用“双”酶切肽图法进行一级结构鉴别试验和序列覆盖率分析。结果MALDI-TOF MS测得相对分子质量45.01×10^(3);SEC-MALS得到其单体相对分子质量为45.17×10^(3)(±0.226%);两种相对分子质量测定方法结果一致。CE-SDS(非还原)纯度为98.77%,其他成分1.23%;SE-HPLC纯度为98.07%,其他成分1.93%;两种纯度测定方法结果一致。强阳离子交换共鉴定到14种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.08%,主峰占比26.22%,碱性峰占比21.70%;CZE鉴定到8种电荷异构体组分,其中酸性峰占比52.10%,主峰占比25.27%,碱性峰占比22.63%;两种电荷异构体鉴别方法,酸性组分、主峰与碱性组分,分布规律一致。“双”酶切肽图法实现重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的序列100%覆盖,实测序列与预期序列一致。结论建立了重组Ⅲ型人源化胶原蛋白关键质量参数分析方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国重组Ⅲ型人源化胶原蛋白的质量控制提供了参考依据。

热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选

【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。

自转运蛋白作为细菌表面展示系统的研究进展

细菌表面展示技术已成功应用于生物技术、生物医药等诸多领域。在众多细菌表面展示系统中,基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统因其强大的外源蛋白展示能力,展现出良好的应用潜力和应用前景。本文综述了当前已发现的自转运蛋白的种类、已解析的自转运蛋白的结构及其分泌过程,概述了基于自转运蛋白构建的细菌表面展示系统的优点及其应用情况。

理性设计盐桥构建伯克霍尔德菌脂肪酶热稳定突变体

【目的】借助蛋白质工程技术提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA的热稳定性,以期更好地将其应用于工业生产中。【方法】利用YASARA、Fold X、Rosetta、Gromacs等生物信息学软件,构建1个脂肪酶Lip A的热稳定性提高的微型突变体电子文库;通过对突变体的结构信息和自由能变化进行评估,筛选出潜在的有价值的突变体。继而利用基因定点突变技术,构建上述候选突变体的突变基因文库,通过实验筛选出热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。【结果】利用上述方法,从构建的20个脂肪酶LipA突变体中,筛选到热稳定性有显著提高的3个突变体LipA-Asn^(125)Asp、LipA-Asn^(125)Glu和LipA-Gln^(262)Glu。经55°C处理12 min后,上述3个突变体的T1250值较野生型分别提高4.0°C、5.5°C和4.4°C;在55°C下的半衰期较野生型分别提高了2.2倍、3.8倍和2.6倍。【结论】利用生物信息学软件,构建脂肪酶LipA突变体电子文库,结合蛋白质的结构信息,可以快速筛选到热稳定性提高的脂肪酶LipA突变体。