Y染色体短串联重复序列微流控芯片复合扩增检测体系研究

目的构建Y染色体短串联重复序列(Y-STR)微流控芯片扩增检测试剂,并进行性能验证,实现Y-STR基因座的快速全集成检测。方法使用Y-STR微流控芯片检测体系,对其灵敏度、成功率和分型准确率、峰平衡性、精准性和准确性、检材适应性、混合物检测能力和抗抑制性进行验证评估。结果DNA标准品9948的模板量≥8 ng,血卡片数≥3片以及口腔拭子刮擦次数≥7次时可获得Y-STR完整分型;165份样本的全集成检测成功率为91.52%,分型准确率为99.74%;不同荧光通道之间的峰高比值为89.81%;10次运行的等位基因分型标准品的片段大小标准差均在0.5 bp以内,20份样本全集成检测的等位基因片段和相应的等位基因标准品之间的片段准确性均在0.5 bp以内;能够对口腔拭子、血卡、唾液卡、烟蒂、血棉签、布片精斑等检材进行准确分型;混合样本中较小贡献者与较大贡献者在1∶3的比例时可获得完整基因分型;在不同浓度的腐殖酸(50~400 mg/L)、靛蓝(20~100 nmol/L)、血红蛋白(100~500μmol/L)等抑制物的干扰下,该体系可获得完整基因分型。结论该体系可应用于国产Quick TargSeq法医DNA现场快速检测系统使用,可在法医学实践中选用。

单管直扩38重祖先信息InDels体系的构建及其在微流控芯片系统的应用

本文基于插入-缺失多态性(insertion-deletion polymorphism,InDel)遗传标记,从相关文献和dbSNP库中筛选出38个在东亚、欧洲、非洲人群中具有等位基因频率差异的祖先来源InDel位点,同时整合Amelogenin位点和Y染色体STR(DYS439)位点,以辅助未知样本的性别鉴定,采用PCR-CE技术构建了可以区分三大洲际人群的单管直接扩增复合检测体系,该体系可与微流控芯片系统相结合,1.7 h内完成DNA样本自动化扩增和电泳分型,利用公共数据库1000Genomes中16个人群1 607名个体的分型数据对筛选的38个InDel位点进行初步评估;同时对构建的38-plex InDels体系的灵敏度、准确性、直接扩增能力进行验证评估;检测5种不同人群的779份样本和215份唾液卡、血卡的直接扩增样本,采用聚类分析和主成分分析方法,评价体系的推断准确性.结果表明该38-plex InDels复合检测体系分型准确,灵敏度达157 pg,能够对唾液卡和血卡直接扩增,可以区分三大洲际人群及其混合人群,能够准确推断待测样本的族群来源、估算祖先成分,且通过集成细胞裂解步骤将有望2h实现"样本进-结果出"式快速自动化InDel分型.

基于胶体金检测核酸适配子与蛋白相互作用的新方法

基于核酸适配子对靶蛋白的高特异性及胶体金比色法的高度灵敏性,建立了一种分析核酸适配子与靶蛋白亲和力以及简便快速检测蛋白质的新方法.核酸适配子保护的胶体金在高盐条件下可保持稳定,靶蛋白与胶体金竞争结合适配子,使胶体金发生聚沉,呈现颜色变化,可通过检测A520值分析适配子与靶蛋白的亲和力以及蛋白浓度.通过对适配子浓度、靶蛋白浓度、共孵育时间、竞争反应时间和氯化钠浓度等关键因素进行优化,确定了最佳检测条件.

适于标记核酸适配子胶体金的制备及性能

为了获得适于标记寡核苷酸适配子的胶体金,对制备工艺条件进行了优化：20 mL 0.1 g/L氯金酸溶液中添加10 g/L柠檬酸三钠500 μL,pH=3.0,初始沸腾时间小于4 min,加入还原剂后反应时间为6 min.通过紫外可见光谱扫描和透射电镜对其性能进行鉴定,获得了分散均匀、直径15～20 nm的胶体金颗粒,可准确标记核酸适配子,且将胶体金标记的链霉素适配子与半抗原小分子链霉素进行反应,可对链霉素进行定性和半定量检测,满足利用胶体金标记适配子检测靶物质的需要.

基于微流控芯片的InDel快速族群推断体系研究

目的QuickTargSeq全集成法医DNA现场快速检测系统是国内首台自主研制的现场快检仪,可应用于InDel族群推断检测,2 h左右完成“样本进-结果出”的快速自动化InDel分型。本文对InDel族群推断微流控芯片检测体系的性能进行评估,以期为实践应用提供参考。方法使用InDel族群推断微流控芯片检测体系,对体系的灵敏度、干扰物耐受性、成功率、分型准确率、精确性、准确性、峰平衡性及检材适应性进行验证评估,同时对测试样本的族群来源进行推断。结果138份样本的全集成检测成功率为95.65%,分型准确率为98.85%;DNA模板量≥5 ng时,可获得完整InDel分型,口腔拭子样本最佳采集次数为口腔内壁左右两侧各刮擦8次,血卡样本最佳检测方式为6片(Φ=2 mm);所有基因座的平均杂合子峰高比值为0.86;10次运行的等位基因分型标准物(allelic ladder)片段大小标准差均在0.3 bp以内,测试样本等位基因和相应的等位基因分型标准物之间的片段准确性均在0.5 bp以内。结论该体系可实现对口腔拭子、血卡、唾液卡及烟蒂样本的准确分型,能够准确推断样本的族群来源。

Quick TargSeq全集成DNA快速检测系统在案件中的应用

常规法医DNA检验包括DNA提取、PCR扩增、电泳检测、数据分析等环节,需要专业人员在实验室用不同仪器操作6~8 h完成。然而,面对突发案(事)件,现有技术耗时长、步骤多、实验场所要求高等不足限制其作出适时到位的应对。为此,国外先后推出了RapidHIT等现场快检仪器,但价格昂贵且只能用于个体识别。Quick TargSeq全集成DNA快速检测系统是国内首台自主研制的现场快检仪,2 h即可完成检验全过程,可以实现DIP族群推断和STR个体识别功能。本文利用该系统检测了一起案件的现场物证及血样,促进了案件的侦破。

一种适用于SELEX技术的单链DNA制备方法

为了建立一种简单、高效制备高纯度单链DNA方法,用于SELEX技术筛选过程中次级文库的筛选,对制备链霉亲和素磁珠的实验条件进行了优化,确定了对称PCR产物与链霉亲和素磁珠偶联的最佳时间和饱和度,并验证了不同浓度NaOH对解链效果的影响,建立了适于SELEX技术的单链DNA制备体系。利用荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳对本实验所建立方法及传统不对称PCR法制备单链DNA的回收效率和纯度进行了比较,结果表明在最优实验条件下用磁性分离法制备的单链DNA纯度及回收效率均显著高于不对称PCR法。