核定位信号及其分析策略

真核细胞核膜上的核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)是细胞核内外进行物质交换的主要通道,分子量较小的化合物可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核,而分子量为50kD以上的蛋白质则只能通过主动转运进入细胞核.以这种方式进入细胞核的蛋白质必须在其氨基酸序列上拥有特殊的核定位信号(nuclear localization signal,NLS),以被相应的核转运蛋白(karyopherins)识别.核定位信号具有多样性,包括经典核定位信号(classical NLS,cNLS),内输蛋白β2识别的核定位信号(又称PY模体-NLS)和其它类型的NLS.每一类NLS具有相似的特征,但并不具有完全保守的氨基酸组成.不同的NLS,往往对应着各不相同的核输入机制.而对同一蛋白质来说,也可能同时拥有几个功能性的NLS.研究核定位信号一方面可以帮助揭示新的大分子物质核转运机制,另一方面也有助于发现一些蛋白质的新功能.本文对常见NLS的分类进行了总结,并介绍了两种常用的NLS预测软件及鉴定NLS的一般策略.

凝溶胶蛋白抑制乳腺癌细胞MCF7/Her2增殖及迁移侵袭的作用

目的研究凝溶胶蛋白(gelsolin,GSN)对雌激素受体α(ERα)阳性、人表皮生长因子受体2(Her2)过表达乳腺癌细胞MCF7/Her2生长的作用。方法构建GSN的真核表达载体,并稳定转染MCF7/Her2细胞,以RT-PCR及Western Blot鉴定得到稳定过表达GSN的乳腺癌细胞系MCF7/Her2/GSN。以空载体转染的稳定表达细胞MCF7/Her2/V作对照,比较其细胞形态、增殖和迁移能力的改变;Western Blot及RT-PCR检测Her2、组织金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP3)表达和细胞外调节蛋白激酶(ERK)的活化,探索深层次的作用机制。结果 MCF7/Her2稳定过表达GSN后,细胞形态改变且增殖及迁移、侵袭能力明显低于对照细胞;发现Her2表达下降,TIMP3的表达上调,而雌激素导致的MCF7/Her2细胞ERK活化增强被逆转。结论凝溶胶蛋白能降低Her2的表达,并通过下调ERK的活化及上调TIMP3的表达,抑制乳腺癌细胞MCF7/Her2增殖及迁移侵袭作用。

开设医学本科生自主设计性生物化学实验的实践

设计性实验是实验教学的新型教学模式,通过在临床医学专业本科生物化学实验教学中开设了设计性实验课程,培养了学生的科学思维能力、实际动手能力和勇于开拓的创新意识,充分调动了学生学习的主动性和创造性,取得了良好的教学效果。

脂多糖诱导的小鼠急性呼吸窘迫综合征中microRNA-27a和PPARγ表达变化

目的研究脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导小鼠急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)模型中外周血和肺内microRNA-27a和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ,PPARγ)表达变化规律,探讨microRNA-27a和PPARγ在ARDS发病机制中的作用。方法将50只8~10周雄性C57BL/6小鼠分为模型组不同给药时间(3、6、12、24 h各10只)和对照组(n=10)。通过尾静脉注射LPS建立ARDS模型,通过组织学病理评价、炎症反应细胞分泌物表达水平等炎症反应指标评价ARDS模型建立的有效性。Western blot和免疫组织化学(IHC)观察模型不同时间点肺内PPARγ表达及变化趋势;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步研究基因表达改变情况。结果与对照组相比,模型组不同时间点肺组织病理改变明显;外周血和肺内不同时间点microRNA-27a表达明显增加,外周血各时间点较变化对照组增加2~4倍,差异有统计学意义[3 h(3.53±0.89),6 h(1.97±0.40),12 h(1.87±0.35),24 h(1.98±0.53),P<0.05]。与对照组相比,肺内microRNA-27a 6 h(3.08±0.97)、24 h(3.49±0.94)表达增加差异有统计学意义;3 h(1.90±0.87)、12 h(1.88±0.62)差异无意义。PPARγ在蛋白水平表达明显减少;基因水平上外周血PPARγ6、12 h表达降低差异有统计学意义[P<0.05,6 h(0.31±0.19),12 h(0.37±0.43)],3(0.70±0.33)、24 h(0.80±0.44)差异无统计学意义;肺内6、12、24 h表达降低差异有统计学意义[P<0.05,6 h(0.60±0.23),12 h(0.71±0.12),24 h(0.42±0.20)],3 h(0.67±0.36)差异无统计学意义。结论 LPS诱导小鼠ARDS模型中,microRNA-27a和PPARγ表达发生明显变化,二者可能参与ARDS发病过程。

核定位信号分析示踪载体——pGST-EGFP的构建及功能鉴定

目的 构建谷胱甘肽转硫酶（GST）与EGFP相融合的新型蛋白质示踪载体--pGST-EGFP,以用于蛋白质细胞亚定位信号序列的深入分析.方法 以质粒pEGFP-N1为骨架,融合从pGEX-2TK载体中扩增的GST编码序列,构建成pGST-EGFP融合表达质粒;再插入人工合成的已知核定位蛋白SV40的核定位序列（NLS）,构建成pGST-EGFP-SV40 NLS作为阳性对照;另外,构建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融合表达质粒.将对照pEGFP-N1和各重组质粒分别用脂质体介导,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察蛋白的核定位情况.结果 单独表达的EGFP呈全细胞分布,而GST-EGFP融合蛋白只存在于细胞浆;SV40 NLS能将GST-EGFP融合蛋白带进细胞核.虽然TNNI2-EGFP融合蛋白的细胞亚定位呈现核内丰度更高的特点,但TNNI2-GST-EGFP融合蛋白仅限定于胞浆分布,提示TNNI2不能主动定位到细胞核中.结论 成功构建了蛋白质细胞亚定位示踪载体--pGST-EGFP.作为核定位信号分析系统,其对小分子蛋白细胞亚定位的示踪效果优于传统的pEGFP载体,更适用于科研工作中小分子量蛋白质核定位信号序列的研究.