香草醛“促膜通窍”提高耐药铜绿假单胞菌对亚胺培南敏感性的机制研究

目的:前期研究表明中药开窍药安息香中主要成分香草醛能降低膜结构的稳定性、提高渗透率,基于此考察香草醛能否提高铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)对其一线用药亚胺培南的敏感性,并探讨其增效作用的可能机制。方法:以PA标准菌株ATCC27853和临床分离多重耐药PA(PA2019~32)为实验对象,倍比稀释法测定亚胺培南和香草醛的最低抑菌浓度(MIC);微量棋盘法测定联合用药指数(FIC);基于所得FIC指数,测定联合用药的时间杀伤曲线;采用illunima二代测序平台,比较ATCC27853在有无香草醛干预下的转录组改变,采用基因组比对、差异鉴定、通路分析和表型分析确定核心靶标;结合亚胺培南进入PA菌体机制,RT-qPCR检测香草醛对转运通路pae01501中oprD基因表达的影响;尾静脉注射最小致死量(MLD)PA2019~32构建小鼠细菌感染模型,造模后分别灌胃给予140mg/kg香草醛,31.2mg/kg庆大霉素及相同剂量香草醛+庆大霉素,262.4mg/kg的亚胺培南以及等剂量香草醛+亚胺培南,通过考察120h内各组动物死亡率进一步验证药物联用是否增强药物的体内抗感染保护作用。结果:单用香草醛对PA基本无抗菌作用(MIC>512μg/mL);针对ATCC27853,亚胺培南单用及与香草醛联用的MIC值分别为2和1μg/mL,针对PA2019~32两者MIC值分别为4和2μg/mL;两者联用时,针对ATCC27853及PA2019~32的FIC值均为0.5625;单用亚胺培南时两菌株从8h至48h均呈现明显增殖;1/2MIC亚胺培南+1/16MIC香草醛联用时,两菌株均出现增殖停滞;转录组学共组装比对出7134个基因,香草醛可显著改变ATCC27853转录本的整体轮廓,其中差异性表达基因共623,含425个上调基因和198个下调基因;GO和KEGG分析表明上调基因主要富集于ABC转运体和不同环境下的微生物应激通路,下调通路中显著富集的有多种糖和核酸原料代谢等通路;香草醛显著增强两菌株外膜孔蛋白oprD基因表达量,并且呈现出显著的量效关系;在体内动物实验结果显示,120h内模型组小鼠存活率为8.3%,香草醛为16.7%;单用亚胺培南和庆大霉素小鼠存活率分别为33.3%和8.3%,当香草醛与亚胺培南及庆大霉素联合使用后小鼠存活率可提高至50.0%和41.7%,药物联用后明显提高了模型小鼠生存率。结论:香草醛与亚胺培南联用虽为相加作用,但联用具有显著的时间杀伤优势,能停滞两菌株的生长繁殖。这一作用与香草醛抑制多种糖和核酸原料代谢有关。最为重要的是,香草醛可改变细菌外膜转运体的多种功能,特别是可剂量依赖性地升高亚胺培南进入胞体所需要的OprD蛋白的基因表达。因此“促膜开窍”很可能是香草醛提高药物抗菌效应的关键机制。

基于转录组学探讨穿心莲内酯对铜绿假单胞菌的抗菌增效机制

目的:基于前期研究结果,探索穿心莲内酯(Andrographolide,Andr)对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的抗菌增效作用机制。方法:利用illunima二代测序平台,比较PA标准菌株ATCC27853在有无Andr干预下的细菌转录组改变,采用基因组比对、差异鉴定、通路和表型分析确定核心靶标;考察在不同浓度穿心莲内酯(100、50、25μg·mL^(-1))干预下ATCC27853绿脓毒素(Pyocyanin,PYO)的分泌量;结合Andr可能的作用机制,RT-q PCR检测其对PA代谢过程中关键基因phz M、phz H、phz S和pvd I表达的影响;尾静脉注射临床分离耐药PA(PA2019-32)构建小鼠急性细菌感染模型,分别给予左氧氟沙星(阳性对照组)、左氧氟沙星联合Andr(联合用药组),观察记录各组小鼠的存活情况,连续观察5 d,绘制生存曲线,测评Andr联合抗菌药物的体内抗感染保护作用。结果:转录组学共组装对比出289个显著差异基因,其中145个基因显著上调,144个基因显著下调。差异基因的GO富集分析显示,差异基因主要涉及细胞代谢过程、细胞组成及“铁离子结合”;KEGG分析差异基因在42条通路中高度富集,主要涉及各类抗菌药物抗性通路,能量代谢相关通路以及毒力因子相关通路,其中色氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、泛醌和其他萜类-泛醌、辅助因子的生物合成、β-内酰胺抗药性、离子抗菌肽(CAMP)抗药性显著下调(pvalue<0.01~0.05)。RT-q PCR检测结果显示,Andr对pvd I无影响,但显著降低phz H和phz S的表达,同时phz M的表达升高,影响铜绿假单胞菌PYO的生物合成过程。验证实验证实Andr降低了PYO的生成,并且体内感染模型实验表明Andr与左氧氟沙星联合使用可显著提高感染小鼠的存活率。结论:通过干扰PYO的合成,调控Fe转运,增强CAMPs活性,可能是Andr最终实现“减毒”和“增效”的重要原因。

锦灯笼UPLC-Q-Orbitrap HRMS指纹图谱及抗菌活性的谱效关系

建立不同产地锦灯笼(Physalis Calyx seu Fructus,PCF)的指纹图谱,并进行抗菌活性的谱-效关系研究。采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)建立16批锦灯笼指纹图谱,对共有峰进行归属,并进行聚类热图和主成分分析;检测不同产地锦灯笼提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性,采用灰色关联度分析进行谱效关系的研究。建立的锦灯笼指纹图谱共标定38个共有峰,根据精确的分子离子峰质量数及二级碎片信息,查阅相关文献等发现其中包括了22个蔗糖脂肪酸酯类成分、4个酸浆苦素类成分以及木犀草苷、木犀草素等化学成分;聚类分析和主成分分析将16批锦灯笼均按照不同产地进行了分类。16批锦灯笼提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的抑菌活性,灰色关联分析表明,峰27(关联度≥0.85)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性贡献较大,峰37、29、30、19、33、35、31、17、32、20和28(关联度≥0.85)对大肠杆菌的抑菌活性贡献较大,且这些特征峰均为蔗糖脂肪酸酯类化合物,表明蔗糖脂肪酸酯类成分对于锦灯笼发挥抗菌活性具有很大的贡献。通过建立锦灯笼质谱指纹图谱及初步谱效关系,筛选出锦灯笼中对抑菌活性贡献较大的特征峰,为进一步研究锦灯笼的药效成分及药理作用提供参考。