构建携带人PAPS合成酶1(hpapss1)全长cDNA的重组腺病毒

目的构建携带人PAPS合成酶1(hpapss1)全长cDNA的重组腺病毒,并感染巨噬细胞使PAPSS1过表达,为研究其在胆固醇代谢中的作用提供工具。方法PCR扩增hpapss1全长cDNA,继而构建了真核表达载体pCDNA3.0-hpapss1,再将hpapss1片段亚克隆入腺病毒穿梭质粒pshuttle-CMV,得到转移质粒pshuttle-CMV-hpapss1,并将其转化含腺病毒基因组质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态菌(AdEasier-1cells)。筛选并鉴定重组正确的腺病毒质粒pAdEasy-1-hpapss1,在阳离子脂质体介导下,转染腺病毒包装细胞(293细胞)进行包装和扩增。携带hpapss1全长cDNA的重组腺病毒感染THP-1来源的巨噬细胞48h后,用Western blot方法测定蛋白水平来确定PAPSS1的过表达。结果成功制备携带hpapss1全长cDNA的重组腺病毒,滴度为5.3×108pfu/mL,实现了hpapss1基因在巨噬细胞中的过表达。结论携带hpapss1全长cDNA的重组腺病毒的成功制备为进一步探讨PAPSS1及氧化固醇硫酸化在巨噬细胞胆固醇代谢平衡中的作用及机制建立了很好的模型和工具。

大鼠心肌微血管内皮细胞的培养及基因芯片分析的研究

目的:用血管内皮细胞生物学功能基因芯片研究培养的大鼠心肌微血管内皮细胞特征。方法:用植块法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,利用倒置显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察培养细胞的形态学特征;利用免疫细胞化学方法显示血管内皮细胞特异性表面标志;用细胞计数方法绘制细胞生长曲线;用血管内皮细胞生物学功能基因芯片研究细胞基因表达谱,并比较原代细胞和传代细胞基因表达的变化。结果:利用植块法培养的大鼠心肌微血管内皮细胞具备多种典型微血管内皮细胞(MVEC)特征:细胞呈多边形或梭形并呈铺路石样生长; 存在管腔样结构(TLS)和毛细血管网络,细胞表面有丰富的微绒毛;CD34、CD31、CD105、VW因子和TIE-2阳性;多种与正常血管功能密切相关的基因不同程度表达,前2代细胞特征稳定。结论:用植块法培养的大鼠心肌微血管内皮细胞,具备微血管内皮细胞的特征,原代和第2代培养细胞特征稳定,可用于心血管疾病的基础与临床研究。

siRNA干扰CD73表达抑制人乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质的黏附

目的:探讨CD73对乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质黏附的影响及其机制。方法:①构建CD73 siRNA表达载体,脂质体介导转染MB-MDA-231细胞。②流式细胞仪检测瞬时转染效率,G418筛选稳定转染克隆。③半定量RT-PCR和W estern b lotting检测转染细胞CD73 mRNA及蛋白表达。④细胞黏附实验检测MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制后与细胞外基质黏附力的改变。结果:①CD73 siRNA表达载体转染MB-MDA-231可有效抑制CD73 mRNA表达(抑制效率=91.0%),P<0.01。②CD73 siRNA表达载体转染MB-MDA-231可有效抑制CD73蛋白表达(抑制效率=79.3%),P<0.01。③干扰MB-MDA-231细胞CD73表达可显著抑制细胞与细胞外基质的黏附(P<0.01)。结论:①CD73 siRNA表达载体可有效干扰MB-MDA-231细胞CD73基因表达。②MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制可显著降低细胞与细胞外基质的黏附。

高脂血症小鼠心脏和肺组织中eNOS及HO-1的表达

目的观察高脂饲料喂养的小鼠心脏和肺组织中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxide syn-thase,eNOS)及血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的含量变化,探讨高脂血症对eNOS和HO-1表达的影响。方法高脂饮食组(n=8)和普通饮食组(n=8)C57BL/6小鼠分别经高脂饲料和普通饲料喂养18周后,测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipopro-tein,HDL)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)含量,采用Real-ti me PCR检测心脏和肺组织中eNOS及HO-1的mRNA水平,以免疫组化方法检测其蛋白表达。结果高脂饮食组TC、TG和LDL明显高于普通饮食组,HDL则低于普通饮食组;高脂饮食组心脏和肺组织中eNOS的mRNA和蛋白水平低于普通饮食组,HO-1的mRNA和蛋白水平高于普通饮食组。结论高脂饲料喂养能使小鼠形成高脂血症,并引起心脏和肺组织中eNOS的表达降低,同时HO-1的表达升高。

人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立

目的 检测正常人血清类胰蛋白酶含量 ,为肥大细胞相关疾病的诊断提供依据。方法 随机抽取正常人血清标本和 1例过敏性休克死亡患者血清 ,用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法检测类胰蛋白酶的水平。结果 2 0 6份正常人血清类胰蛋白酶含量的平均值为 2 .2 4ng/mL。过敏性休克死者血清类胰蛋白酶含量为正常人的 5 0倍。结论 本实验建立了较灵敏的检测类胰蛋白酶的ELISA法 。

4,5,7-三羟基异黄酮对绒癌耐药细胞株JAR/MTX增殖、凋亡和侵袭的影响及相关机制

目的:研究4,5,7-三羟基异黄酮(genistein)对绒癌耐药细胞株JAR/MTX增殖、凋亡和侵袭能力的影响,并探讨其影响侵袭的相关机制。方法:分别采用MTT法、Annexin-Ⅴ和PI双染法、transwell小室法,检测不同浓度genistein作用于JAR/MTX细胞72 h后细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化。采用RT-PCR技术检测雌激素受体(ER)以及与侵袭有关的MTA3、Snail基因mRNA的表达,采用蛋白印迹法和明胶酶谱法检测E-钙黏附蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)和9(MMP-9)蛋白的表达。结果:Genistein能抑制JAR/MTX细胞的增殖和侵袭能力,并呈剂量依赖关系。小剂量genistein(10μmol/L)仅能引起少部分JAR/MTX细胞凋亡,而25、50、100μmol/L genistein则引起大量细胞凋亡和坏死。JAR/MTX细胞经genistein作用后,ERβ和MTA3的mRNA表达量多于对照组,Snail基因的mRNA表达量少于对照组。E-cadherin的蛋白表达大于对照组,MMP-2和MMP-9的蛋白表达量少于对照组。结论:Genistein能抑制JAR/MTX细胞的增殖,诱导细胞凋亡和坏死,通过上调E-cadherin和下调MMP-2以及MMP-9的表达、抑制JAR/MTX细胞的侵袭能力,MTA3→Snail→E-cadherin通路可能是genistein抑制JAR/MTX细胞侵袭的信号通路之一。

RNA干扰技术抑制类风湿关节炎成纤维细胞COX-2合成

目的体外合成针对人环氧化酶-2(hCOX-2)的小分子干扰RNA(siRNA),并转染入人滑膜成纤维细胞,通过比较不同siRNA抑制COX-2 mRNA表达、COX-2蛋白合成以及下游产物PGE2水平,旨在确定特异性阻断人滑膜成纤维细胞COX-2的siRNA。方法分离、培养和传代人类风湿关节炎(类风关)滑膜成纤维细胞。设计合成4条针对hCOX-2 mRNA siRNA(1#-4#siRNA),1条随机序列siRNA。设立1#-4#siRNA和随机序列siRNA组(NC)及未转染对照组(CTL组)。应用Lipofect AMINE2000将上述siRNA分别转染人滑膜成纤维细胞,4h后各培养孔加入终浓度为100nmol/L的佛波酯。转染36h、48h后,各组提取蛋白质和总RNA,应用RT-PCR检测hCOX-2 mRNA表达水平,通过Western Blot检测hCOX-2蛋白表达水平。采用ELISA方法检测各组上清液PGE2的水平。结果转染36h,PCR结果显示,CTL、NC、1#siRNA、2#RNA、3#RNA、4#siRNA、阳性对照HeLa细胞组hCOX-2 mRNA电泳条带密度值分别为1、0.72、0.3、0.25、0.4、0.04、2.1。WesternBlot结果提示上述各组hCOX-2蛋白密度值分别为1、1.04、0.52、0.39、0.9、0和2.48。转染48h后,各组hCOX-2蛋白条带密度值分别为0.05、0.52、0.51、0.9和0.15。转染24h、48h和72h后,4#siRNA组培养上清液PGE2的水平较其他各组低。结论4#siRNA能有效抑制人滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达和COX-2蛋白的合成,且上清液中PGE2水平最低,证实4#siRNA能特异性阻断COX-2在滑膜成纤维细胞表达。

不同月龄和血脂水平ApoE基因敲除小鼠体内类固醇激素合成急性调节蛋白的表达(英文)

目的检测不同月龄和不同血脂水平载脂蛋白E敲除小鼠体内类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)的表达水平。方法实验分别选取雄性和雌性1天龄新生鼠、1月龄、3月龄及5月龄载脂蛋白E敲除小鼠(apoE-/-)及对照C57BL/6J小鼠,每组6只,共16组。利用试剂盒检测不同年龄小鼠的血脂水平。利用实时定量RT-PCR及Western blot方法检测不同年龄和血脂水平下,小鼠肝脏中StAR基因和蛋白的表达。结果相比同年龄同性别的正常对照小鼠,载脂蛋白E敲除小鼠血清中含较高水平的低密度脂蛋白(LDL)和较低水平的高密度脂蛋白(HDL)。在对照小鼠中,StAR基因和蛋白表达水平随月龄增加逐渐下降;但是在载脂蛋白E敲除小鼠体内,因为血脂水平的提高,StAR基因和蛋白表达水平呈现先增高后降低的趋势。结论StAR通过调节脂质代谢,可作为一个有效调节动脉粥样硬化以及其他心血管疾病的调节因子。

类胰蛋白酶对血管内皮细胞表达干细胞因子的作用及机制

目的研究类胰蛋白酶对血管内皮细胞(ECV304细胞系)表达干细胞因子的作用及其机制。方法采用RT-PCR方法检测类胰蛋白酶刺激后ECV304细胞炎症介质干细胞因子(stem cell factor,SCF)表达情况,用Western blot方法研究p38和JNK的表达及磷酸化。采用单因素方差分析干细胞因子mRNA的表达以及t检验分析p38和c-Jun N末端激酶(JNK)磷酸化。结果类胰蛋白酶能够上调ECV304细胞的干细胞因子mRNA的表达,类胰蛋白酶也可以诱导细胞内p38的磷酸化,以上作用均可被PAR2单克隆抗体抑制。结论在ECV304细胞中,类胰蛋白酶经蛋白酶激活受体2通过p38的磷酸化,最终上调表达干细胞因子。

低氧增强小鼠脑微血管内皮细胞CD73表达

目的:探讨低氧对小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3细胞CD73的表达及活性的影响。方法:①构建bEnd.3细胞低氧模型。②用乳酸脱氢酶检测试剂盒测定细胞上清液中乳酸脱氢酶的含量。③高压液相层析法检测细胞CD73的活性。④半定量RT-PCR法检测细胞CD73的mRNA表达。⑤生物素化bEnd.3细胞表面蛋白,继而用免疫沉淀及Westernblot方法检测CD73蛋白表达。结果:①低氧24h之后bEnd.3细胞乳酸脱氢酶漏出显著高于正常对照组(P<0.01)。②低氧能刺激bEnd.3细胞表面CD73的酶活性增高,并呈时间依赖性(P<0.05)。③低氧4h、8h,bEnd.3细胞CD73mRNA表达增加(P<0.05)。④低氧12h、24h,bEnd.3细胞表面CD73蛋白表达增加(P<0.05)。结论:低氧刺激小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3CD73mRNA、蛋白水平及酶活性的提高。

人卵巢癌细胞C－erbB－2扩增及表达抑制TNF和LAK杀伤活性的实验研究

利用人卵巢癌细胞株，在确定Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增和过表达及Ｃ－ｅｒｂＢ２正常拷贝和低表达的基础上对Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及表达与ＴＮＦ和ＬＡＫ杀伤活性的关系进行研究，并以非特异性杀伤物Ｈ２Ｏ２为对照。结果表明：Ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增及过表达可明显抑制ＴＮＦ和ＬＡＫ的杀伤活性（Ｐ＜０．０５），但对Ｈ２Ｏ２的杀伤活性无显著影响。提示临床上部分卵巢癌患者用ＴＮＦ和ＬＡＫ治疗的疗效低或无反应性与Ｃ－ｅｒｂＢ－２的扩增及过表达有关。

甲孕酮对人卵巢癌3AO细胞C－erb B－2表达和形态学的影响

采用流式细胞和电镜技术，检测了甲孕酮处理前后人卵巢癌３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达和形态学改变情况。结果表明甲孕酮可使部分３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达下降；部分３ＡＯ细胞发生形态学改变，提示甲孕酮具有低调部分人卵巢癌３ＡＯ细胞Ｃ－ｅｒｂＢ－２表达和诱导部分３ＡＯ细胞分化的作用。

去甲斑蝥素对胆囊癌细胞体外模拟血管生成拟态的抑制作用

目的探讨去甲斑蝥素对GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞系体外三维培养血管生成拟态形态学影响。方法 Transwell小室及鼠尾Ⅰ型胶原收缩试验测定GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞系体外侵袭迁徙力,运用Matrigel胶、鼠尾Ⅰ型胶原三维培养基质建立GBC-SD、SGC-996胆囊癌细胞三维培养模型,观察细胞侵袭力高低与血管生成拟态相关性,并运用电镜、光镜观察血管生成拟态形态学构成;在三维培养模型中加入NCTD后动态观察NCTD对血管生成拟态形态影响。结果①GBC-SD胆囊癌细胞侵袭迁徙能力显著高于SGC-996胆囊癌细胞(P=0.0013),高侵袭GBC-SD胆囊癌细胞在Matrigel胶、鼠尾Ⅰ型胶原三维培养基质中均能形成管状结构,而低侵袭SGC-996胆囊癌细胞不能形成管状结构②第1天至第4天,GBC-SD TIMP2干预组收缩指数明显低于GBC-SD组(F=353.88,P<0.0001;F=525.8,P<0.0001;F=190.02,P=0.0002;F=196.26,P=0.0002),高侵袭性GBC-SD细胞收缩指数显著高于低侵袭性SGC-996细胞(F=318.73,P<0.0001;F=911.25,P<0.0001;F=268.88,P<0.0001;F=243.14,P<0.0001);仅第2天,GBC-SD TIMP1干预组收缩指数显著低于GBC-SD组(F=52.66,P=0.0019)③NCTD可抑制胆囊癌细胞侵袭迁移能力,促使细胞凋亡,抑制细胞三维培养基质中管道形成。结论三维培养模型能模拟体内细胞生长条件,GBC-SD胆囊癌细胞侵袭迁徙能力显著高于SGC-996胆囊癌细胞并能在三维培养基质中形成管状结构,NCTD能抑制胆囊癌细胞体外血管生成拟态形成。

灵芝对体外培养的微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的研究不同剂量灵芝对体外培养的大鼠肺微血管内皮细胞的增殖与凋亡的影响。方法在体外培养肺微血管内皮细胞中做细胞增殖曲线 ,用流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化。结果培养中加入灵芝 (2.75mg/ml)后第4d开始细胞增殖 ,第7d达高峰(与阴性对照比 )。流式细胞仪分析 ,各剂量组G2-M期细胞明显增多 (与阴性对照比 ) ,但细胞凋亡百分率无显著变化。结论灵芝能促进体外培养的肺微血管内皮细胞增殖作用 ,此作用对保护内皮损伤。

重组人尿激酶原病毒安全性研究

目的:对经过提纯及病毒灭活处理后的重组人尿激酶原(rhpro-UK)进行病毒安全性实验研究。方法:将SRSV/3T3细胞以及本产品Sp2/0基因工程细胞培养上清液感染NIH/3T3细胞分别作阳性对照组1和2,将不同浓度的rhpro-UK原液感染NIH/3T3细胞为实验组。各组细胞盲传3代,分别进行XC细胞合胞形成实验和透射电子显微镜观察病毒颗粒。结果:rhpro-UK原液的高、中、低3个浓度组(1,0．15,0．03mg·mL^(-1))均未见到合胞体形成,透射电子显微镜下均未观察到病毒颗粒,与2个阳性对照组比较有显著性差异(P＜0．01)。结论:重组人尿激酶原(rhpro-UK)原液中不含有逆转录病毒。

rhTNF和化疗药物对人卵巢癌3Ao细胞株杀伤活性的研究

目的研究重组人肿瘤坏死因子（ｒｈＴＮＦ）和化疗药物对人卵巢癌３Ａｏ细胞株的杀伤活性。方法应用ＭＨ法测定ｒｈＴＮＦ和顺铂（ＤＤＰ）、更生霉素（ＫＳＭ）、环磷酰胺（ＣＴＸ）、依托泊甙（ＶＰ１６）联合疗法对３Ａｏ细胞的杀伤活性。结果ｒｈＴＮＦ对３Ａｏ的细胞毒性作用随浓度增高而增强，４种化疗药物单用时，ＤＤＰ对３Ａｏ细胞的细胞毒性最高，而且呈现明显的剂量依赖关系，ＫＳＭ与ｒｈＴＮＦ联用对３Ａｏ细胞有较强的协同细胞毒性。结论ｒｈＴＮＦ与不同的化疗药物联用对人卵巢癌３Ａｏ细胞株有不同的杀伤活性。

肥大细胞类胰蛋白酶促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-435的跨膜侵袭

目的研究类胰蛋白酶对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435侵袭力的影响及其机制。方法通过体外细胞侵袭力试验观察不同浓度、不同时间类胰蛋白酶对乳腺癌MDA-MB-435细胞跨膜侵袭力的影响，并利用RT-PCR以及明胶酶谱法研究类胰蛋白酶对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）表达水平的调节。结果150～500pmol／L的类胰蛋白酶可以促进MDA-MB-435细胞的跨膜侵袭；还可以促进MMP-2、TIMP-2的mRNA表达（P〈0．01）和MMP-2的蛋白表达（P〈0．05）。结论类胰蛋白酶可以促进人乳腺癌细胞系MDA-MB-435细胞的跨膜侵袭，该作用可能与增加MMP-2的mRNA和蛋白表达、TIMP-2的mRNA表达相关。

类胰蛋白酶对微血管内皮细胞中IL-6和TNF-α表达的影响

目的研究肥大细胞类胰蛋白酶(tryptase)对小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3表达白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响以及可能的信号途径。方法bEnd.3细胞与不同浓度的类胰蛋白酶共同培养后,用RT-PCR和放射免疫的方法检测细胞及其上清液中IL-6、TNF-αmRNA和蛋白的表达量以及蛋白酶激活受体2(PAR-2)对其表达的影响。结果类胰蛋白酶上调bEnd.3IL-6和TNF-αmRNA的表达和分泌,并呈时间和剂量依赖性,这一作用可能是通过激活细胞膜上的PAR-2而发挥的。结论肥大细胞类胰蛋白酶参与bEnd.3微血管内皮细胞的致炎性反应。

PKB在类胰蛋白酶诱导基因表达中的作用

目的探讨蛋白激酶B(PKB)在类胰蛋白酶(tryptase)诱导基因表达中的作用。方法采用RT-PCR和Western blotting方法,检测tryptase对ECV304细胞PKB(Akt)的表达及其活性和对转录因子AP-1、NF-κB p65亚单位、JNK、p38MAPK、趋化因子IL-8表达的影响。结果在ECV304中1μg/Ltryptase可使PKB蛋白质磷酸化水平增加并促进PKB、转录因子NF-κB P65亚单位、AP-1和趋化因子IL-8的表达,但对JNK、p38MAPK表达影响不大。PI3K特异性抑制剂LY294002可抑制PKB的表达增加,同时可抑制NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加;反义PKB质粒瞬时转染ECV304,可抑制PKB、AP1、NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加;PAR2的抗体可抑制PKB的磷酸化,但不能阻断PKB表达。结论在ECV304细胞tryptase经其膜受体PAR2通过PI3K促进PKB的磷酸化而激活之,通过其下游途径促进趋化因子IL-8、转录因子AP-1、NF-κB P65亚单位和PKB本身的表达增加。

分叉双歧杆菌对小鼠腹水瘤的抑制作用

本文观察了分叉双歧杆菌对小鼠腹腔移植的淋巴细胞腹水瘤(SRS)的抑制作用。结果发现,分叉双歧杆菌在SRS瘤细胞移植前或移植后应用,均能明显抑制瘤细胞的生长,特别在移植后应用,抗瘤效果更显著。主要表现为荷瘤小鼠存活时间延长、存活率提高。将该菌预先进行处理或不处理后加入体外培养的SRS瘤细胞中,发现该菌对离体的瘤细胞生长也有直接抑制作用。