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美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质
被引量:
9
1
作者
闫晓平
赵丹
+4 位作者
郭巍
王伟
张雅昆
郜玉杰
赵坤莉
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第5期849-858,共10页
【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和...
【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn^(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg^(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co^(2+)和Fe^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe^(2+)激活作用越强,而Co^(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。
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关键词
美国白蛾
几丁质脱乙酰酶
克隆表达
酶学性质
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职称材料
通辽市开鲁县膜下滴灌技术应用及总结
2
作者
马立新
霍振平
+3 位作者
王继芳
何刚
黄浦海滨
赵坤莉
《内蒙古水利》
2007年第4期38-39,共2页
膜下滴灌技术是一种集成的高效节水灌溉技术。分析和研究了通辽市开鲁县节水灌溉技术应用,对该项技术的应用和实施进行了归纳总结,提出了今后需要进一步研究和探索的问题。
关键词
开鲁县
滴灌
应用
效果
经验
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职称材料
Bt Cry2Ab对美国白蛾的杀虫活性及与几种中肠受体蛋白体外结合特性分析
被引量:
3
3
作者
王哲
赵丹
+4 位作者
常梦颖
赵坤莉
乔英翠
陆秀君
郭巍
《蚕业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第4期435-440,共6页
美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害我国蚕区桑树的重要害虫之一,为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对其作用机制,本文利用大肠埃希菌表达苏云金杆菌Bt Cry2Ab蛋白,在活性测定基础上进行毒素蛋白与美国白蛾中肠...
美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害我国蚕区桑树的重要害虫之一,为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对其作用机制,本文利用大肠埃希菌表达苏云金杆菌Bt Cry2Ab蛋白,在活性测定基础上进行毒素蛋白与美国白蛾中肠类钙黏蛋白(cadherin)功能区(HcCAD-1、HcCAD-2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)HcALP1、HcALP3的结合特性分析。原核表达并纯化的Bt Cry2Ab蛋白用美国白蛾3龄幼虫进行生物测定,对幼虫生长发育抑制作用明显,当质量浓度为224 mg/L时抑制率为71.14%,抑制中浓度为68.44 mg/L。将Bt Cry2Ab毒素分别与美国白蛾HcCAD-1、HcCAD-2、HcALP1、HcALP3重组蛋白进行体外配体印迹试验,Bt Cry2Ab与HcCAD-2、HcALP1重组蛋白发生特异结合,而与HcCAD-1、HcALP3不结合,推测HcCAD-2、HcALP1可能为美国白蛾Bt Cry2Ab蛋白的中肠受体蛋白。
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关键词
美国白蛾
Bt
Cry2Ab蛋白
类钙黏蛋白
碱性磷酸酶
配体印迹
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职称材料
题名
美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质
被引量:
9
1
作者
闫晓平
赵丹
郭巍
王伟
张雅昆
郜玉杰
赵坤莉
机构
河北农业大学植物保护学院
北京农学院植物科学技术学院
出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第5期849-858,共10页
基金
国家自然科学基金(31471775)
国家现代农业(花生)产业技术体系(30971910)
北京市百千万人才工程项目
文摘
【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA1&2的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn^(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg^(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg^(2+)和Ca^(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co^(2+)和Fe^(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe^(2+)激活作用越强,而Co^(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。
关键词
美国白蛾
几丁质脱乙酰酶
克隆表达
酶学性质
Keywords
Hyphantria cunea
chitin deacetylase
cloning and expression
enzymatic characterization
分类号
S763.42 [农业科学—森林保护学]
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职称材料
题名
通辽市开鲁县膜下滴灌技术应用及总结
2
作者
马立新
霍振平
王继芳
何刚
黄浦海滨
赵坤莉
机构
通辽市水利勘察设计院
通辽市牧区水利工作站
鄂温克水政监察大队
通辽市水务局
通辽市水保局
出处
《内蒙古水利》
2007年第4期38-39,共2页
文摘
膜下滴灌技术是一种集成的高效节水灌溉技术。分析和研究了通辽市开鲁县节水灌溉技术应用,对该项技术的应用和实施进行了归纳总结,提出了今后需要进一步研究和探索的问题。
关键词
开鲁县
滴灌
应用
效果
经验
分类号
S275 [农业科学—农业水土工程]
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职称材料
题名
Bt Cry2Ab对美国白蛾的杀虫活性及与几种中肠受体蛋白体外结合特性分析
被引量:
3
3
作者
王哲
赵丹
常梦颖
赵坤莉
乔英翠
陆秀君
郭巍
机构
河北农业大学植物保护学院
河北省核桃工程技术研究中心
出处
《蚕业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第4期435-440,共6页
基金
河北省重点研发计划项目(20326812D)
国家重点研发计划项目(2018YFD0201000)
+1 种基金
现代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)
河北省自然科学基金项目(C2017204072)。
文摘
美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害我国蚕区桑树的重要害虫之一,为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对其作用机制,本文利用大肠埃希菌表达苏云金杆菌Bt Cry2Ab蛋白,在活性测定基础上进行毒素蛋白与美国白蛾中肠类钙黏蛋白(cadherin)功能区(HcCAD-1、HcCAD-2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)HcALP1、HcALP3的结合特性分析。原核表达并纯化的Bt Cry2Ab蛋白用美国白蛾3龄幼虫进行生物测定,对幼虫生长发育抑制作用明显,当质量浓度为224 mg/L时抑制率为71.14%,抑制中浓度为68.44 mg/L。将Bt Cry2Ab毒素分别与美国白蛾HcCAD-1、HcCAD-2、HcALP1、HcALP3重组蛋白进行体外配体印迹试验,Bt Cry2Ab与HcCAD-2、HcALP1重组蛋白发生特异结合,而与HcCAD-1、HcALP3不结合,推测HcCAD-2、HcALP1可能为美国白蛾Bt Cry2Ab蛋白的中肠受体蛋白。
关键词
美国白蛾
Bt
Cry2Ab蛋白
类钙黏蛋白
碱性磷酸酶
配体印迹
Keywords
Hyphantria cunea
Bt Cry2Ab protein
Cadherin
Alkaline phosphatase
Ligand blot
分类号
S888.739 [农业科学—特种经济动物饲养]
TQ458 [化学工程—农药化工]
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职称材料
题名
作者
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发文年
被引量
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1
美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质
闫晓平
赵丹
郭巍
王伟
张雅昆
郜玉杰
赵坤莉
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2017
9
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职称材料
2
通辽市开鲁县膜下滴灌技术应用及总结
马立新
霍振平
王继芳
何刚
黄浦海滨
赵坤莉
《内蒙古水利》
2007
0
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职称材料
3
Bt Cry2Ab对美国白蛾的杀虫活性及与几种中肠受体蛋白体外结合特性分析
王哲
赵丹
常梦颖
赵坤莉
乔英翠
陆秀君
郭巍
《蚕业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2020
3
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职称材料
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