羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21(DE3)中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。

布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析

本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b(Omp2b)基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。

羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21（DE3）工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16M株Wzt基因序列（登录号：AF047478.1）同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30ku,位于25～35ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。

基因Ⅳ型戊型肝炎病毒 ORF3对 HEK293细胞 MAPKs磷酸化的影响

为了分析戊型肝炎病毒ORF3蛋白对于靶细胞MAPK磷酸化的影响,应用人磷酸化MAPK抗体微阵列比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的磷酸化MAPK表达谱,筛选获得显著上调/下调的磷酸化MAPK。结果表明,在稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞,p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK1、p-ERF2、p-RSK1的表达水平升高,而p-P38б表达水平降低。结果表明,ORF3蛋白影响了HEK293细胞的p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK1、p-ERF2、p-RSK1、p-P38б等MAPKs的磷酸化水平,为HEV ORF3对于靶细胞磷酸化MAPK表达影响的分子机制研究提供了重要依据。

牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494bp的目的片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。

布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。

牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

基于海口市动物基因工程重点实验室获得的牛乳状瘤病毒13型(BPV-13)基因组序列信息(GenBank登录号:KM258443.2),以基因组为模板,扩增E5基因片段,将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-E5-N1,测序正确后瞬时转染HEK293细胞,应用荧光显微镜、流式细胞仪、Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果显示,E5片段大小为135bp;重组质粒pEGFP-E5-N1构建正确;荧光显微镜下观察转染重组质粒pEGFP-E5-N1的HEK293细胞,可见明亮的绿色荧光;流式细胞术分析结果显示,转染重组质粒pEGFP-E5-N1 48h后,约55.59%的细胞表达绿色荧光蛋白;Western blotting结果表明,表达的融合蛋白大小约为32ku。本试验结果为下一步研究E5基因的作用机理奠定了基础。

基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3表达的蛋白(pORF3)对L02细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响

为了探讨基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3(ORF3)表达的蛋白(pORF3)影响靶细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的分子机制,试验运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱,筛选出表达水平上调/下调的基质金属蛋白酶。结果表明,在稳定表达pEGFP-ORF3的L02细胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低。本试验结果为戊型肝炎病毒pORF3对L02细胞中基质金属蛋白酶相关蛋白表达影响的分子机制研究提供了理论依据。

羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis)M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果表明,成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达。该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础。

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。

马尔他布氏杆菌KdtA基因的克隆及原核表达

为了研究马尔他布氏杆菌KdtA蛋白的功能,根据GenBank中公布的马尔他布氏杆菌M5-90株KdtA基因序列,利用DNAMAN软件设计上、下游引物,以M5-90株的基因组DNA为模板,采用PCR对其进行扩增,凝胶回收纯化后得到1 341bp的目的片段;然后构建克隆重组质粒pMD20-T-KdtA,将其转化到大肠杆菌DH5α;待测序正确后,构建原核表达质粒pET-28a(+)-KdtA,再将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对基因的表达情况进行分析检测。结果表明,成功克隆了KdtA基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了KdtA基因;经诱导后得到了预期的目的蛋白,证明KdtA基因得到了成功表达。

口疮病毒ORF020基因的原核表达与纯化

根据Gen Bank中口疮病毒ORF020基因序列,利用DNAMAN软件设计引物,以口疮病毒基因组为模板,采用PCR扩增出552bp的目的基因片段。凝胶回收纯化目的片段,将其连接入p MD20-T载体,转化E.coli DH5α并测序。测序正确后再其再连接入p ET-28a(+)表达载体,构建重组质粒p ET28a(+)-ORF020,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的目的蛋白,镍亲和层析纯化目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达载体p ET28a(+)-ORF020,并在E.coli BL21中表达了ORF020基因,诱导得到的融合蛋白与目的蛋白大小一致,证明目的基因被成功表达并得到纯化蛋白。上述研究结果为开展ORF020的功能研究奠定了一定基础。

马尔他布氏杆菌divK基因的克隆与原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌M 5-90株divK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中M5-90株divK基因序列,设计了1对引物;以此菌株的基因组为模板,用设计的引物扩增出了372 bp的基因片段。用凝胶回收纯化目的基因片段,并将其与pMD 20-T载体连接,转化大肠杆菌(E.coli)DH 5α后测序;测序正确后将此基因片段克隆到pET-28a(+),构建重组质粒pET28a(+)-divK;然后,把构建好的重组质粒转化入E.coli BL 21(DE3)。1 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,诱导表达的蛋白与目的蛋白的大小一致,说明本研究成功构建了pET28a(+)-divk原核表达载体,并在E.coli BL21中成功表达了divK基因。