肉碱棕榈酰基转移酶2过表达载体构建及在奶牛乳腺上皮细胞中验证

为进一步研究CPT2基因在脂质代谢中的作用,试验构建了绿色荧光CPT2过表达载体,将其转入奶牛乳腺上皮细胞,通过荧光定量方法,检测CPT2基因mRNA的表达水平差异,在细胞水平验证了CPT2过表达载体的表达效率。结果表明:过表达组的CPT2基因mRNA表达量与对照组(空载组)相比有所提高。说明CPT2过表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞后,CPT2基因mRNA表达水平显著升高。

FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及在牛胎儿成纤维细胞中的验证

构建了带有绿色荧光标记的法尼基二磷酸法尼基转移酶1（farnesyl—diphosphate farnesyltransferase1，FDFT1）基因shRNA干扰载体以及过表达载体，将其转染牛胎儿成纤维细胞（bovine fetal fibroblasts，BFF），采用荧光定量PCR和Westernblot的方法，检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平，在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。结果显示：shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNANC组的40．7％（P〈0．01），蛋白质表达水平降低至shRNANC组的39．61％（P〈0．01）；而FDFT1基因pBI-CMV3-FDFT1过表达组FDFT1基因mRNA的表达水平为pBI-CMV3空载体组的137．9倍（P〈0．01），蛋白表达水平升高至空载体组的2．34倍（P〈0．01）。本试验通过荧光定量PCR和Western blot的检测方法验证了FDFT1基因过表达载体及干扰栽体转染BFF后，FDFT1基因表达量的变化，为进一步研究FDFT1基因对胆固醇代谢和脂质代谢的影响和作用机制提供了实验材料及分子依据。