人参发根的诱导及其适宜培养条件的研究

利用发根农杆菌A4 菌株在人参根外植体上直接诱导产生发根。在 1 2MS固体培养基上建立起发根离体培养系 ,经连续多代的培养 ,发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明 ,发根农杆菌Ri 质粒的rolC基因已在人参发根基因组中整合并得到表达。液体培养基中发根生长速度约为固体培养的 2倍。经对发根中人参皂苷含量及比生长速率的测定 ,筛选出高产发根系R992 3。利用HPLC法测定了R992 3发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd的含量 ,人参总皂苷含量达 15 2mg g。确定 1 2MS培养液 (3 0g L蔗糖 )、摇床转速 110r min、每 2周更换一次培养液、继代培养时间 4周 ,为人参发根生长适宜条件。探讨了培养容积。

发根农杆菌诱导人参产生发根及离体发根中人参皂甙含量的测定

发根农杆菌A4菌株诱导人参 (PanaxginsengC .A .Meyer)产生发根 ,诱导率 31 .6%。转化发根可在无任何激素的MS培养基上快速生长 ,且具有分枝性强、丛生、无向地性等特点。通过对液体培养条件的选择 ,发现人参发根在 1 /2MS液体培养基上 ( 2 5℃、1 1 0r/min摇床上暗培养 )获得最大生长速率 ,经 1 4d培养 ,人参发根鲜重增加了 7.97倍。利用高效液相色谱法测定发根中人参皂甙含量发现 ,发根系R992 3中人参单体皂甙Rb1 含量达到 1 0 .38mg/g ,超过栽培六年生人参根中Rb1 含量 ( 6.45mg/g)。用高压纸电泳方法在人参发根中检测到农杆碱及甘露碱的存在。Southern点杂交证明 :本研究获得的人参发根确已被A4菌株Ri质粒的T -DNA所转化 ,并被整合到人参发根DNA上。

产木糖醇菌株的筛选及发酵条件优化

从玉米芯中筛选到1株高效转化D-木糖为木糖醇的酵母菌株e。经形态学鉴定及26S rDNA D1/D2区序列分析,将菌株e鉴定为Trichosporon coremiiforme(丝孢酵母)。采用单因素及正交试验优化设计研究了发酵法生产木糖醇的工艺,结果表明:酵母菌株e发酵法生产木糖醇的工艺参数为:碳源质量浓度为40g/l,氮源质量浓度为6g/l,起始pH为7,接种量为6%。

抑制齐墩果烷型人参皂苷合成支路对达玛烷型人参皂苷生产能力的影响

表达反义βAS的5个人参发根系在液体培养条件下生长30天后,齐墩果烷型人参皂苷R0含量比对照实验组均有所降低,幅度分别达13%～40%;达玛烷型人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1含量在5个发根系中均有所增加,其中发根系A19的上述单体皂苷含量总和比对照实验组提高了30%;培养过程中达玛烷型人参皂苷含量呈逐渐增加趋势。5个发根系的βAS酶活性比对照实验组均有所下降,最多下降30%,DAS酶活性被上调,尤其发根系A19的酶活性比对照实验组提高了20%;化学分析结果显示,5个发根系人参皂苷前体物2,3-氧化角鲨烯的含量比对照实验组均有所提高。

高产人参发根系的建立及发根中皂苷Rb_1的分离纯化

利用发根农杆菌A4菌株在2年生人参根外植体上直接诱导产生人参发根。对16个人参发根系比生长速率及人参总皂苷含量进行测定,得到3个具有较高比生长速率和人参皂苷含量的发根系。其中发根系R9923具有最高的比生长速率,在连续培养4周后生长量比最初提高了28.8倍。研究R9923发根系的生长曲线和皂苷含量变化规律发现,随着发根生物量的增加,发根中皂苷含量积累得也越多。利用HPLC法测定了R9923发根系中单体皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。生长4周的人参发根总皂苷含量达15.2 mg/g,其中人参皂苷Rb1的含量为68.3%,比3年生栽培人参中Rb1含量高1.3倍,可以用于大规模培养。用硅胶柱层析法从人参发根总皂苷中分离提纯人参皂苷Rb1,当洗脱剂中氯仿∶甲醇=7.5∶2.5(体积比)时洗脱效果较好。用硅胶柱法提取的皂苷Rb1纯度为89.95%,得率为72.7%。

西洋参发根的诱导及不同外源物质对发根生长和皂苷含量的影响

利用发根农杆菌A4菌株在西洋参根外植体上直接诱导产生发根,并分析不同浓度的植物激素6-BA、NAA,前体物醋酸镁(Mg(Ac)2)、L-亮氨酸和诱导子茉莉酸甲酯(MJA)、水杨酸(SA)对西洋参(Panax quinquefolium L.)发根生长和皂苷含量的影响。同时,研究MJA与SA组合作用对皂苷含量的影响。采用高效液相色谱法测定发根中单体皂苷Rb1的含量。结果显示,适宜浓度的外源物质均可促进皂苷含量的增加,MJA尤其明显。

人参皂苷合成相关β AS基因的克隆及其反义植物表达载体的建立

以发根农杆菌A4菌株诱导的人参发根为材料,用改良的异硫氰酸胍法提取总RNA,得到了纯度好的完整的总RNA。利用RT-PCR扩增了β香树素合成酶基因,测序结果表明该目的片段与GenBank上的β香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体pMD-119T,并转化大肠杆菌。在此基础上,利用pBI121质粒载体,构建了人参β香树素合成酶基因的反义植物表达载体,为这一基因的反义调控研究打下基础。

嗜热乳酸菌的筛选及其在玉米淀粉湿法生产浸泡工艺中的应用

从淀粉生产车间的玉米浆中筛选出耐50℃高温的嗜热乳酸菌,以不同浓度接种量接种嗜热乳酸菌到玉米浸泡水中,研究嗜热乳酸菌对缩短玉米浸泡时间的效果。结果表明,选育的嗜热乳酸菌适应浸泡环境,接入10%的嗜热乳酸菌可缩短玉米细胞破壁所需有效乳酸浓度到达的时间,由传统工艺的20 h缩短为14 h;乳酸菌发酵有效地降低了浸泡水的pH值,在玉米浸泡过程的第1阶段不加入SO_2同样可以抑制其他微生物的生长。

人参皂苷Rb1单克隆抗体的制备与鉴定

用人参皂苷Rb1分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）反应合成了交联抗原GRb1-BSA（GRb1与BSA的结合比为10：1）和GRb1—OVA（GRb1与OVA的结合比为8：1）。以GRb1—BSA为免疫原，分5次免疫3只BAuyC小鼠，取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，Hat筛选，有限稀释法克隆。建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。采用ELISA（酶联免疫吸附测定）间接法和竞争法检测抗体的特异性。结果获得了一只小鼠分泌抗体效价达1：16000，并获得两株分泌GRb1的单克隆抗体的细胞系，分别命名为1F7和1G3，单抗检测显示在0．01～1μg／mL呈线性关系，GRb1的检测范围达50～350ng／mL，两株单抗针对相同的抗原决定簇，制备的单克隆抗体可用于GRb1含量的检测和分离。

诱导人参发根的rolC基因植物表达载体构建及其在人参中的表达

根据Slightom等RiA4TL DNA序列分析结果 ,设计了一对引物 ,以Ri 质粒DNA为模板 ,利用PCR方法对rolC基因进行了扩增。利用pGEM T载体对rolC基因进行了克隆和测序。结果 ,克隆的DNA片段序列与报道的ORF1 2阅读框内的rolC序列一致。将pGEM T rolC用限制性内切酶SacI酶切 ,与经SmaI酶切CIAP去磷酸化的pUC1 9质粒重组 ,经蓝白斑筛选得到正向重组的pUC1 9 rolC。再用Xbal SacI双酶切pUC1 9 rolC与pBI1 2 1 ,将rolC基因定向克隆到具有CaMV35S启动子的pBI1 2 1表达质粒上 ,构建成植物表达载体pBI rolC。用pBI rolC转化农杆菌LBA440 4构建成的LBA440 4 (pBI rolC)工程菌转化人参子叶 ,获得发根的表达。经PCR扩增分子检测 ,证明rolC基因确已整合到人参发根基因组中。经对转化的人参发根中单体皂苷含量测定 ,发现发根中含有所检测的 7种人参单体皂苷 ,总皂苷含量达 1 8 5 5mg g。

利用发酵法和酶法综合技术改进玉米淀粉生产湿法浸泡工艺

通过设计三水平三因素正交实验优化了嗜热乳酸菌发酵和菠萝蛋白酶酶法综合加工工艺,获得玉米淀粉的浸泡工艺条件为:浸泡水温度50±2℃;嗜热乳酸菌接种量10%;发酵浸泡玉米时间12 h,然后加入0.2%菠萝蛋白酶作用4 h,精磨后分离获得淀粉。改进后的工艺过程不添加SO2,浸泡时间从传统的48 h缩短至16 h。

产中性蛋白酶菌种的选育及其在玉米淀粉生产浸泡工艺中的应用

从玉米淀粉生产企业的玉米浸泡水中筛选出可在中性pH值条件下降解蛋白质的菌种;经对该菌种进行原生质体紫外诱变处理,其蛋白酶活性提高了198%;将不同浓度的发酵液添加到玉米淀粉生产的浸泡水中,替代SO2。方差分析表明,菌液的作用时间和SO2含量对淀粉得率的影响显著。得到的优化组合为:玉米先在添加0.1%SO2的浸泡液中浸泡18h,然后在pH值7.0条件下加入20%的蛋白酶发酵液,继续浸泡10h。改进方法后获得的淀粉得率为67.71%,总的浸泡时间缩短至28h。

人参主要农艺性状的相关和通径分析

本文对人参的13个主要农艺性状进行了相关和通径分析。结果表明,以高产为目标的人参选育工作在选择时,应遵循以下原则:地上部在保证较大叶面积前提下,着重选择茎粗的植株,并适当降低株高;地下部选择以根粗为主,适当增加根长,降低根茎的长度。

人参农家类型主要经济性状的遗传特性研究

通过对人参农家类型子代11个主要经济性状的比较试验,发现类型间有7个性状的差异达到显著水平,特别是单产、单根重、根粗等性状的差异达极显著水平。同时,利用5个主要产量性状进行了遗传分析,表明人参不同农家类型的产量和产量构成因素有较高的遗传力;单根重、根粗、茎粗与单产呈极显著正相关关系,各产量因素与产量均有较大的选择改良潜力;单根重+根粗+茎粗构成的选择指数方程,遗传进度最快,是对人参成龄植株选择的理想方案。通过选择指数方程对人参各农家类型进行了多性状综合评价,结果二马牙的选择指数最高,大马牙次之,圆芦居间,长脖类型最小。

人参不同类型苗期主要数量性状的差异及亲缘关系探讨

应用方差分析和聚类分析对人参各类型苗期17个主要数量性状的差异和亲缘关系进行了研究。结果类型间有12个性状的差异达显著水平;亲缘关系以大马牙与二马牙较近,圆芦与长脖芦较密切。

利用蛋白酶发酵液替代SO_2改进玉米淀粉生产浸泡工艺研究

在确定了地衣芽孢杆菌蛋白酶摇瓶发酵工艺各项参数的基础上,采用改良的实验室生产淀粉方法,将处于产蛋白酶活性高峰期的发酵液添加到玉米浸泡水中,探讨了利用蛋白酶发酵液替代SO_2降解包裹玉米淀粉蛋白质的可行性和工艺条件。结果表明,当玉米在含有0.1%的SO_2(和0.5%的乳酸)的浸泡液中浸泡18h后,加入20%的蛋白酶发酵液继续浸泡6h,淀粉得率为67.79%。与传统工艺相比,淀粉得率提高了9.5%,SO_2含量降低了0.1%,总的玉米浸泡时间由36h缩短至24h。

人参β-AS基因RNAi表达载体工程菌的构建

利用重组PCR和酶切连接技术构建了人参β-香树素合成酶(β-AS)基因RNAi(RNAinterference,RNAi)植物表达载体,再经热转化法转化到发根农杆菌A4菌株中,得到含有人参β-AS基因RNAi植物表达载体的工程菌,为诱导转化人参外植体奠定了基础。

人参根际追施磷的运转和积累

在人参开花前期根际追施NaH_2 ^(32)PO_4,分期测定人参不同器官中放射性强度。结果表明,^(32)P可被人参迅速吸收,并在体内运转和分配。这种分配是不平均的,主要集中在生命活动旺盛的部位,并随生育期的变化发生转移和再分配。

利用玉米浸泡水发酵生产L(+)-乳酸

对以玉米浸泡水浓缩液(CCSL)为基础的简化培养基进行了优化。结果表明,由80g/L葡萄糖、40g/L玉米浸泡水浓缩液和0.2g/LMnSO4.H2O组成的发酵培养基获得了68.5g/L的乳酸产量,与完全培养基产量基本相同。使用数学模型对发酵过程中乳酸的生成和葡萄糖的消耗进行了模拟和预测分析。

当前人参混杂程度与集团选育效果

通过对我国目前栽培人参混杂程度的调查,指出在参业生产上人参混杂状况十分严重,强调了人参育种的重要性和必要性。经过几年的人参集团选择育种收到了初步成效。集团选育当代优良类型的产量比混杂系提高25％～37％;第二代产量比混杂系提高12.5％～24.5％;集团选育当代和子代在产量上有明显的正相关,遗传力h^2=0.877;集团选育后代的单株重、根型等数量性状经选择后都得到了不同程度的纯化;如经多代选择效果会更佳。提出集团选育是在近期内解决我国参业无良种的有效方法,各级部门应给予重视。