体外施用小分子RNA抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果

[目的]本文旨在分析体外施加靶向细胞色素b(Cytb)的小分子RNA对稻瘟病菌致病性的抑制作用。[方法]将稻瘟病菌与双链小分子RNA(ds-sRNA MoCytb-21)共同孵育,通过测定孢子萌发效率和形态,确定小分子RNA对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成有抑制作用。在分别施加溶剂(对照组)或dsRNA MoCytb-500(处理组)的情况下,使用稻瘟病菌菌株Guy11侵染水稻‘日本晴’,明确体外施加小分子RNA是否可以降低稻瘟病菌的致病能力。[结果]与对照相比,与小分子RNA共同孵育的稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。2′-O-甲基修饰(OMe)和硫代甲氧基修饰(SOMe)能够延长小分子RNA的抑制效果。用Guy11和dsCytb混合喷施的水稻病斑面积较对照组显著降低。[结论]体外施加特异性靶向稻瘟病菌Cytb的小分子RNA能够抑制稻瘟病菌的致病性,具有开发成为高效绿色环保RNAi药剂的潜力和价值。

柑橘黄龙病的传播介体-柑橘木虱在广东果园的发生调查

柑橘木虱是重要害虫也是柑橘黄龙病的传播介体,因此调查木虱发生动态及其携带黄龙病菌的情况对指导黄龙病的防控有重要意义。本研究调查了广东多个果园的黄龙病发病情况,观察了柑橘木虱的生物学特性,统计了柑橘木虱在不同月份的发生数量,检测了木虱携带黄龙病菌情况。结果发现:失管果园中,黄龙病发病严重且木虱数量大,已成为散播病害的重要源头,而与失管果园保持一定距离且加强木虱防控可减轻黄龙病危害;还发现:广东地区6月份柑橘木虱种群已有一定数量,7、8月,其种群数量再次攀升,到了9、10月份,种群数量保持在高位。11、12月间,种群数量快速下降。最后根据本研究的调查结果,提出了一些加强黄龙病防控的措施。

柑橘多个品种和多个部位中黄龙病菌的检测与调查

探索黄龙病菌在柑橘多个品种和植株多个部位中的分布情况,可为研究该菌在植株内的侵染扩散奠定基础;调查多个果园的柑橘植株感染黄龙病的情况,可为病害防控提供科学依据。通过常规和巢式PCR检测了黄龙病菌在柑橘多个品种和植株多个部位中的存在情况,并进一步调查了龙门、阳春、肇庆、云浮等地柑橘园中的柑橘植株感染黄龙病的情况。结果发现:在砂糖橘、贡柑、甜橙、脐橙、马水橘和春甜桔中,黄龙病阳性检测率较高,而在佛手和粗柠檬中,黄龙病阳性检测率较低。在染病的植株的根茎花果叶根中均可检测到黄龙病菌,但黄龙病菌在植株内的分布并不均匀。此外,研究发现,失管果园和附近的柑橘植株携菌率很高,而老病树挖除后补栽的一些小柑橘苗的携菌率也很高。

大豆叶片57kD钙依赖蛋白激酶自磷酸化性质的研究

本实验证明大豆叶片质膜上 5 7k D钙依赖蛋白激酶具有较强的体外自磷酸化活性 ;并且其体外自磷酸化水平受到人工诱导衰老处理的明显促进及外源 6-BA预处理的有效抑制 ,暗示该激酶可能参与外源细胞分裂素对大豆叶片衰老的调控过程 .进一步的生化分析表明 ,其自磷酸化位点可能发生在丝氨酸和苏氨酸等残基上 ,而在酪氨残基上未发生磷酸化反应 .

以omp基因为靶标的3种检测方法对柑橘黄龙病菌检测效果比较

为了比较以omp基因为靶标的常规PCR、LAMP检测方法(Loop-mediated isothermal amplification)和实时荧光定量PCR方法在实际检测中对柑橘黄龙病的检测效果,比较了3种检测方法对柑橘黄龙病菌omp基因检测的灵敏度,并运用3种检测方法对采自广东省田间11个本地柑橘品种上疑似感染黄龙病的多个病样进行实际检测。结果显示:3种检测方法的灵敏度有所不同,依次为常规PCR<LAMP检测方法=实时荧光定量PCR。3种检测方法对黄龙病田间样品的检出率依次为常规PCR<LAMP检测方法<实时荧光定量PCR。表明3种方法均可很好地检测黄龙病;其中常规PCR和实时荧光定量PCR适合有一定技术基础的农技人员使用,而后者具有最大的检测灵敏度,但成本较高;LAMP技术虽然是一种新技术,使用者较少,但该方法简单、快捷,且不需昂贵的精密仪器,具有很好的推广应用前景。

柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp外膜重组蛋白,应用PCR方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙病菌omp基因的3个片段,将其克隆到pMDl9-T载体,再亚克隆到pET32a原核表达载体,构建pET32a-omp原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳检测带组氨酸标签的Omp融合蛋白表达后,用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明:柑桔黄龙病菌omp基因序列的两个片段在37℃经1 mmol/L IPTG诱导后,在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小(约55 ku)的融合蛋白。

通过定量蛋白组学研究OsGLO1对稻瘟病抗性的调控机制

[目的]水稻葡糖酸氧化酶1(OsGLO1)定位于水稻过氧化物酶体(peroxisome),参与过氧化氢的产生,但其是否参与水稻对稻瘟病抗性的调控还未见报道。本研究的目的是为了考察OsGLO1在水稻对稻瘟病抗性中的作用。[方法]以水稻‘日本晴’和稻瘟病病菌互作体系为研究对象,使用定量蛋白质组学技术,比较和分析了亲和型和非亲和型稻瘟病菌菌株侵染引起的水稻蛋白质表达变化。[结果]研究发现水稻OsGLO1蛋白的表达受到亲和型稻瘟病菌侵染的特异性抑制,但是在非亲和反应中的表达量变化则不明显。水稻原生质体过表达和沉默试验证明,OsGLO1的表达与水稻活性氧积累以及胼胝质沉积量呈正相关,且OsGLO1过表达诱发水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等多种防卫信号通路相关基因的表达。[结论]OsGLO1可以激活水稻的早期防卫反应,并通过启动多种激素信号通路维持水稻对稻瘟病一定水平的抗性。考虑到其也参与植物对非生物胁迫抗性的调控,提示OsGLO1可能是水稻抵抗生物胁迫以及非生物胁迫中的重要因子。

寄主与病原物互作中小RNA转运机制及应用

灰霉病菌与拟南芥互作中会分泌小RNA进入植物细胞,通过与拟南芥Argonaute 1(AGO1)蛋白相结合,利用寄主的RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制沉默寄主的免疫相关基因,从而抑制拟南芥的免疫反应。相反,寄主也会将小RNA转移到病原菌中,从而抑制病原菌的致病力。最近研究发现拟南芥可以通过类似于外泌体的胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)将小RNA分泌到真菌细胞中。这些含有寄主小RNA的胞外囊泡在侵染部位积累并被真菌细胞吸收,并转运寄主小RNA诱导沉默真菌关键的致病因子,降低灰霉病菌的致病力。因此,在与病原菌的相互进化中,拟南芥通过外泌体介导的跨界RNA干扰抑制病原菌的侵染。本综述回顾了在多种植物-病原物互作体系中开展的小RNA穿梭转运研究,总结了可能的转运机制,讨论了以跨界RNA干扰技术为基础研发的新型环境友好型"RNA杀菌剂"的可靠性和局限性,对于读者了解新型作物病害防治技术具有重要意义。

OsGLO1调控水稻抗稻瘟病的机制研究

[目的]水稻乙醇酸氧化酶1(OsGLO1)是光呼吸中的关键酶,调控植物免疫信号分子过氧化氢(H_(2)O_(2))的产生。本研究旨在分析OsGLO1在稻瘟病抗性中的功能,揭示其调控机制。[方法]利用稻瘟病菌株Guy11分别侵染水稻野生型(ZH11)和OsGLO1基因过表达(OsGLO1-OE)以及沉默(cas9-glo1)的转基因水稻,观察抗病性表型,确定OsGLO1对抗病性的影响。使用稻瘟病菌GZ1(GFP标记)侵染水稻,比较菌丝扩增差异,明确OsGLO1抑制稻瘟病菌侵染后扩展的能力。分别通过定性和定量试验观察和分析H_(2)O_(2)的积累位点和积累量,研究OsGLO1在PTI途径中的作用;通过RT-PCR检测水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)信号通路相关防御基因的表达水平,探明OsGLO1对激素信号途径的影响。[结果]与野生型相比,受Guy11侵染的OsGLO1-OE水稻病斑更小,相对真菌生长量显著降低,附着胞以及侵染菌丝周围的活性氧积累增多,叶片中H_(2)O_(2)含量显著升高;而cas9-glo1在病斑面积和真菌生物量等方面明显高于野生型,被侵染叶片表面附着胞周围活性氧积累无显著变化,侵染菌丝周围的活性氧积累减少,叶片中H_(2)O_(2)含量显著降低。GZ1侵染48 h后,荧光显微观察显示,OsGLO1-OE水稻叶鞘中的稻瘟病菌侵染程度比野生型明显减弱,而cas9-glo1叶鞘中的稻瘟病菌侵染程度比野生型明显增强。OsGLO1过表达能显著提高SA信号途径的防卫基因(如OsPR1a和OsEDS1)的表达水平,但是对JA信号通路基因的表达没有明显影响。[结论]OsGLO1可以通过激活SA信号通路正向调控水稻对稻瘟病的抗病性。

柑橘黄龙病菌与寄主互作过程中4个小RNA的检测及功能分析

[目的]柑橘小RNA不仅是黄龙病抗性的调控因子,也可以开发成为黄龙病早期诊断的分子标记。本研究旨在探明小RNA在柑橘黄龙病与寄主互作中的作用。[方法]分别设计并合成了4个小RNA的反转录茎环引物以及相应的表达检测引物;利用实时荧光定量PCR对引物的特异性和扩增效率进行了测试;进一步检测分析了4个小RNA对靶标基因表达的调控情况。[结果]利用本研究设计的引物在健康样品和黄龙病发病样品中均可特异性检测到4个小RNA。相对定量标准曲线斜率表明,4个小RNA引物的扩增效率相近。表达量的相对定量分析表明:4个小RNA的表达与相应靶标基因的表达均呈负相关性; miR-753E-3p、miR-451b、miR2633和miR838-3p在发病样品中的表达量分别为健康对照样品中的4.69、0.44、0.36和3.08倍,而其靶标Cs6g21280、Cs6g05770、Cs2g08190和Cs8g02530在发病样品中的表达量分别为对照的0.14、8.95、3.06和0.29倍。进一步分析表明:这些小RNA的靶标基因在拟南芥中均存在同源基因:Cs6g21280在拟南芥中的同源基因为ATSMC4,与抑制开花和抑制逆境相关的DNA修复有关; Cs6g05770在拟南芥中的同源基因为BAK1,与病原特征分子诱导的抗病反应有关; Cs2g08190在拟南芥中的同源基因为CIPK23,与促进钾离子吸收、扩大叶片的气孔开度有关;Cs8g02530在拟南芥中的同源基因为PIP2,是一个水通道蛋白,可调节植物耐涝耐旱性。[结论]本研究揭示了黄龙病菌与柑橘在小RNA水平上发生的侵染与防卫的对抗作用,为黄龙病病症形成以及寄主免疫相关分子机制的研究提供了新的线索。

豌豆蚜防控的关键RNAi靶标基因筛选与分析

为筛选防控豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的关键RNA干扰(RNA interference,RNAi)靶标基因,通过构建精氨酸激酶(arginine kinase,AK)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)这3个与豌豆蚜生长发育相关基因的dsRNA,于室内检测ds AK、ds SOD和ds CHS处理后对其致死效果,并比较4种dsRNA递送方式对其致死效果的影响,筛选获得防治效果明显的dsRNA及其递送方式。结果显示,处理48~168 h后,不同基因dsRNA处理组豌豆蚜的死亡率比阴性对照组高2.19倍~4.39倍,其中ds AK处理组豌豆蚜的死亡率为27.7%~91.1%,显著高于ds SOD、ds CHS处理组及阴性对照组。使用ds AK通过人工饲喂法和叶片注射饲喂法处理豌豆蚜,48 h即可出现显著致死效果。ds AK通过人工饲喂方法处理72 h后,豌豆蚜AK基因表达量比空白对照组降低43.2%,同时可抑制豌豆蚜的生长发育,使其体长比阴性对照组减少了5.9%。表明ds AK对豌豆蚜有较好的致死效果,在蚜虫的绿色防控方面有很好的应用前景。

小RNA介导蜡质芽胞杆菌AR156激活MAPK通路诱导拟南芥系统抗病性研究

蜡质芽胞杆菌AR156是一种根围促生细菌,可以诱导拟南芥产生对丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)的系统抗性(Induced Systemic Resistance,ISR)。本研究发现,AR156预处理植物后接种病原菌Pst DC3000后的0 min~60 min内,能够迅速激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)MPK3和MPK6的表达。同时,AR156可诱导mpk3和mpk6单突变体对Pst DC3000的抗性,而在mpk3mpk6双突变体中则丧失诱导抗病的能力,表明MPK3和MPK6在AR156介导的诱导抗病中具有重要调控功能,且存在功能冗余。进一步研究发现,和对照相比,在接种72 h后,AR156可以诱导野生型拟南芥PR1蛋白的表达,但双突变体中并没有诱导作用。接种48 h后,过氧化氢的积累和胼胝质沉积也表现出相似结果。此外,通过对野生型和mpk3mpk6双突变体进行小RNA高通量测序发现,MAPK能够影响miRNA的表达,并通过qRT-PCR证实了部分小RNA的差异表达水平,表明MPK3/6可以调控植物miRNA的积累。研究表明MAPK在AR156激发ISR中发挥重要作用,并参与调控植物miRNA的表达水平。

蛋白质N-糖基化在拟南芥生长周期中的变化规律及去糖基化对根发育的影响

蛋白质N-糖基化修饰在植物生长发育中发挥重要作用。为探究蛋白质N-糖基化在拟南芥(Arabidopsis thaliana)整个生长周期中的变化规律以及去N-糖基化对拟南芥生根发育的影响,通过N-糖链酶解和HPLC与MALDI-TOF-MS分析解析了不同生长时期的拟南芥Col-0植株的N-糖链组成(结构和含量)变化。以BSA溶液为阴性对照,无菌去离子水为空白对照,用N-糖酰胺酶(PNGase Rz)溶液处理拟南芥幼苗8小时;然后继续在MS培养基中培养5天、10天,测量主根长度并检测N-糖链组成的变化。结果显示,从拟南芥中解析出12种N-糖链结构,其中包括4个高甘露糖型和8个复杂型。在拟南芥整个生长周期中,复杂型N-糖链含量始终高于高甘露糖型,其中含木糖和岩藻糖的复杂型结构是N-糖链的主要组成,而Man3XylFucGlcNAc2含量最高。高甘露糖型N-糖链含量由幼苗期的13.87%缓慢上升至抽薹期的19.02%,盛花期回落至17.98%,而在长角果成熟期快速下降至最低点2.36%,衰老期再度小幅回升至5.23%。用高浓度糖酰胺酶液PNGase Rz处理后,可观察到幼苗主根生长受到显著抑制,且培养10天后仍然无法恢复正常;而低浓度酶液处理组与阴性对照组差异不显著,根长和生长状态基本正常。糖链分析结果显示,与对照组相比,高、低浓度酶液处理组的N-糖链组成均发生显著变化,主要表现为高甘露糖型含量显著低于空白对照组,同时随生长时间的延长该差异逐渐减小,最终消失。研究表明,拟南芥N-糖基化组成随着生长发育发生周期性变化,且去糖基化酶处理能够瞬时影响拟南芥蛋白质N-糖基化修饰,进而抑制根的发育。