苦参双功能核酸酶1的体外表达及结构性质分析

植物双功能核酸酶1影响植株生长、发育及衰老,且研究表明其具有抗肿瘤活性。基于苦参转录组数据克隆了苦参(Sophora flavescens Ait.)中双功能核酸酶1基因的开放读码框(SfBFN1),分析其编码蛋白的理化性质和结构特点。采用RT-PCR方法扩增SfBFN1基因片段,纯化后与pET22b (+)载体连接并转化到大肠杆菌感受态细胞BL21,并以不同的诱导条件,筛选其体外表达的最适宜条件。结果获得了SfBFN1的开放读码框片段,长度为984 bp,编码327个氨基酸,SfBFN1蛋白分子质量约为36.2 ku;利用PHYRE2在线软件预测SfBFN1蛋白的部分三级结构,其富含α螺旋与β折叠,5个α螺旋包裹着7个β折叠,构成了蛋白质立体结构的框架。研究为SfBFN1蛋白开发成为抗癌蛋白质药物制剂奠定了实验基础。

异叶天南星苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与蛋白结构分析

以异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)法扩增其苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因Ah PAL,获得该基因的开放读码框(ORF),并通过系统的生物信息学软件分析Ah PAL的结构和理化性质。结果显示,Ah PAL的ORF全长为2184 bp,编码727个氨基酸;Ah PAL与郁金香(Tulipa fosteriana W. Irving) PAL的亲缘关系最近,序列相似性达88%。空间结构模型分析结果显示,Ah PAL为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,其中MIO结构域含有PAL酶家族的保守序列和Ala-Ser-Gly三肽活性中心,是Ah PAL酶活性的决定性结构域。利用荧光定量PCR方法检测3个Ah PAL Unigene在根、块茎和叶中的表达情况,发现它们在根中表达量均最高,而在叶和块茎中表达较低。

多花黄精果糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因克隆及酶结构性质

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行克隆,并分析酶蛋白的理化性质及结构特点。PCFRK开放读码框(ORF)为1725 bp,编码574个氨基酸,具有两个磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序;PCGMPP的ORF为1086 bp,编码361个氨基酸,具有焦磷酸化酶家族的保守位点和活性位点。系统进化树分析发现在已知数据库中PC FRK与深圳拟兰FRK亲缘关系最近;而PC GMPP与芦笋GMPP亲缘关系最近。基因表达分析说明PCFRK和PCGMPP在根状茎中的基因表达总量明显高于其他组织,这与多花黄精根茎中多糖含量高于其他组织是一致的。研究为PCFRK和PCGMPP两种关键酶功能的进一步研究及黄精多糖生物合成途径的解析奠定基础。

苦参热应激蛋白HSP17.8的体外表达及生物信息学分析

利用聚合酶链式反应从苦参植物叶片中扩增出热应激蛋白基因hsp编码区序列,并成功构建了p ET22bhsp原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,在不同温度、时间和不同浓度的IPTG诱导下实现了HSP的体外表达,获得了hsp编码区序列,长度为498 bp,编码166个氨基酸,分子质量约17.8 ku的小分子热应激蛋白(HSP17.8)。对此蛋白的物理化学性质、同源进化树、二级结构以及三维结构等生物信息学分析表明:HSP17.8为稳定的亲水性蛋白,其具有多个N-豆蔻酰化位点、磷酸化位点和N-糖基化位点;与羽扇豆应激蛋白HSP的同源性最高,亲缘关系最近;HSP17.8蛋白的结构特点是α螺旋与β折叠依次出现,形成了β1-α1-β2-α2-β3-α3-β4-α4-β5的折叠方式,且同一方向的β折叠被α螺旋包裹在空间结构的内部,构成了立体结构的框架。首次从苦参中成功克隆热应激蛋白基因hsp17.8编码区序列,并在体外得到了其最佳的诱导表达条件,分析了HSP17.8的理化特性、进化关系及结构特点,为该蛋白结构、功能研究奠定了实验基础。

异叶天南星凝集素基因的克隆及蛋白的结构性质分析

克隆了中药材异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)叶中凝集素(lectin)基因(Ahltn)的开放阅读框(ORF),并对其编码蛋白AhLTN的性质和结构进行了分析。首先从植物异叶天南星的新鲜叶片中提取总RNA,通过逆转录获取cDNA,经PCR扩增Ahltn后与pMD19-T载体连接构成重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中培养,经菌液PCR鉴定后再进行测序验证,确定目的基因被成功克隆,进一步运用各种生物信息学软件对AhLTN的理化性质、进化关系和空间结构进行分析。结果显示,克隆获得了Ahltn的ORF,此基因片段长度为561 bp,编码186个氨基酸的蛋白质,经生物信息学分析AhLTN属于稳定蛋白,AhLTN与铁皮石斛的凝集素亲缘关系最近,四级结构显示其为二聚体,且两个单体的C末端发生了交换,每个单体中含有11个β折叠,呈“三棱镜”型,3个面均有保守的甘露糖结合区域。为天南星植物凝集素基因和蛋白功能的进一步研究和开发利用奠定了基础。

异叶天南星查尔酮合成酶和异构酶基因的克隆及蛋白的结构性质分析

查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)是黄酮类物质生物合成途径中的关键酶,该研究从中药异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume,Ah)转录组数据库中筛选出查尔酮合成酶基因(Ah CHS)和查尔酮异构酶基因(Ah CHI),利用RT-PCR技术克隆了它们的开放阅读框(ORF)部分,并对其编码蛋白Ah CHS和Ah CHI的理化性质、表达及结构特点进行分析。Ah CHS的ORF长度为1 176 bp,编码392个氨基酸的蛋白质;而Ah CHI的ORF长度为630 bp,编码蛋白含209个氨基酸。Ah CHS作为对称同二聚体,N端螺旋互相交换,每个单体由2个亚结构域组成,位于2个亚结构域之间交界处的4个保守的氨基酸残基构成了酶的活性中心; Ah CHI的三级结构采用了开放的β-三明治褶皱,1个大的β折叠片层(β4～β11)和1个α螺旋片层(α1～α7)组成其核心结构,其中β4,β5,α4和α6在不同物种间高度保守,部分疏水氨基酸形成了酶的活性位点。系统进化树分析发现Ah CHS与火鹤花CHS亲缘关系最近;而Ah CHI与紫牡丹CHI亲缘关系最近。表达分析表明编码Ah CHS的基因在根和块茎中的表达量明显比叶多,而编码Ah CHI的基因在块茎部位的表达量最高。该研究为Ah CHS和Ah CHI功能的进一步研究及植物黄酮类化合物生物合成途径的解析提供了基础。